Научная электронная библиотека

Функциональные и метаболические эффекты симпато-адреналовой системы и стресс

Тапбергенов С. О., Тапбергенов Т. С., Советов Б. С.,

7.3. Метод определения активности аденозиндезаминазы

Аденозиндезаминаза (ADA, К.Ф. 3.5.4.4) является одним из ключевых ферментов метаболизма пуринов. Ее низкомолекулярная изоформа является каталитически активным белком с молекулярной массой 36–40 кДа. Высокомолекулярная АДА (Мм 280–300 кДа) представляет собой комплекс каталитической единицы и мембранного фермента дипептидилпептидазы IV. Дефицит аденозин дезаминазы вызывает одну форму тяжелого комбинированного иммунодефицита.

Принцип метода

Аденозиндезаминаза (АДА) катализирует дезаминирование аденозина в инозин с освобождением аммиака. Метод определения активности этого фермента основан на количественном определении аммиака, освобождающегося при дезаминировании аденозина.

По количеству освободившегося аммиака за 30 минут инкубации судят об активности ферментов. Количество аммиака определяется в среде инкубации без его предварительной отгонки с помощью цветной реакции Бертло (С.О. Тапбергенов, С.М. Тапбергенова, 1984). В этой реакции образуется индофенол или родственные ему соединения, окрашенные в синий цвет. В качестве катализатора используется нитропруссид натрия, который не только ускоряет реакцию, но и увеличивает до предела превращение аммиака.

Реактивы:

1. 0,05М фосфатный буфер: 50 мл 0,2 М KH2PO4 + 39,2 мл 0,2 М NaOH до 200 мл дист. водой.

2. 0,2 М КН2РО4: 27,22 г – 1000 мл дист. воды или 13,61 г – 500 мл дист. воды.

3. 0,2 М NaOH: 8 г NaOH – 1000 мл дист воды или 4 г NaOH – 500 мл дист. воды.

4. 0,05 М MgCl2: 4,76 г MgCl2 – 1000 мл дист. воды или 2,38 г MgCl2 – 500 мл дист. воды.

5. 1М KCl: 74,56 г – 1000 мл дист. воды или 37,28 г – 500 мл дист. воды.

6. Реактив № 1: 5 г перегн. фенола + 62,5 мг нитропруссида натрия, до 500 мл дист. водой.

7. Реактив № 2: 50 г Na3PO4 12H2O + 10 мл гипохлорида Na до 500 мл дист. воды.

8. Приготовление гипохлорида натрия (NaClO) удобнее всего получать реакцией между продажной хлорной известью и углекислым натрием:

СаОСl2 + Na2CO3 = CaCO3 + NaClO + NaCl.

Тщательно размешивают 100 г хлорной извести с содержанием активного хлора 35–36 % с 170 мл дистиллированной воды в течение 15 мин и в смесь при непрерывном помешивании вносят раствор 70 г Na2CO3 (тех. сода) в 170 мл воды. Масса сначала густеет, затем опять разжижается. Жидкость отсасывают от осадка через полотняный фильтр. Получается 320 мл раствора гипохлорида натрия с содержанием активного хлора 71–100 г/л.

В день опыта приготовить:

1. Среда инкубации: 60 мл 0,05 М MgCl2 + 4,32 мл 1 М KCl + до 300 мл фосфатный буфер (рН – 7,4).

2. Аденозин 0,4 %: 20 мг + 5 мл фосфатного буфера.

Ход определения

Для одного анализа необходимо 2 пробирки. В первую пробирку вносят 1,5 мл среды инкубации, 0,1 мл биоматериала, 0,2 мл аденозина. (активность аденозиндезаминазы). Во вторую пробирку (контрольную) вносят 1,5 мл среды инкубации, 0,1 мл биоматериала (контроль ткани на содержание аммиака).

Все пробы инкубируют 30 минут при 37 °С в термостате, затем быстро добавляют по 2 мл холодных реактивов № 1 и 2.

Через 30 минут при 37 °С в термостате развивается устойчивая на протяжении 24 часов окраска, интенсивность которой пропорциональна количеству образовавшегося аммиака.

Все пробы центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 10 мин. Прозрачный надосадочный раствор колориметрируют на КФК при длине волны 540 нм, кювета 10 мм, против дист. воды.

Количество аммиака в пробе рассчитывают по калибровочному графику, который строят по стандартным растворам сернокислого аммония. С учетом разницы опыта и контроля рассчитывают активность фермента.

Активность выражают в нмоль аммиака на 1 мг белка. Метод отличается высокой чувствительностью и аналитической надежностью, но при его использовании следует соблюдать все правила работы с ферментами.

Расчет активности аденозиндезаминазы

1. Удельная активность аденозиндезаминазы (АДА) рассчитывается в нмолях аммиака (NH3 определяют по калибровочному графику), образовавшегося в 1 мин (или сек), при 37 °С на мг белка, по следующей формуле:

03.wmf