Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

УМСТВЕННАЯ ОТСТАЛОСТЬ И ХРОМОСОМА Х

Воинова В. Ю., Юров И. Ю., Ворсанова С. Г., Юров Ю. Б.,

Возможные корреляции генотипа и фенотипа при Х-сцепленных формах умственной отсталости и прогнозирование тяжести заболеваний у детей

В нашей работе проведен анализ зависимости фенотипа детей с синдромами FRAXA и RTT от генетических (изменения последовательности ДНК генов МЕСР2 и FMR1) и эпигенетических (особенности инактивации хромосомы Х) факторов.

После открытия мутаций гена МЕСР2 у больных с RTT [Amir et al., 1999] были проведены исследования, посвященные поиску связи между типом и позицией мутации гена МЕСР2 и тяжестью течения заболевания. Полученные авторами результаты носили противоречивый характер (табл. 21).

Так, в некоторых работах утверждалось, что миссенс мутации приводят к легкому течению заболевания по сравнению с нонсенс мутациями и мутациями со сдвигом рамки считывания, а также что мутации, расположенные дистальнее, ближе к 3’– концу гена, имеют относительно легкие клинические проявления [Weaving et al., 2003; Schanen et al., 2004]. Однако в других исследованиях вышеупомянутых корреляций генотипа и фенотипа не было обнаружено [Huppke et al., 2000; Hoffbuhr et al., 2001; Colvin et al., 2004].

Несовершенство используемых ранее клинических шкал могло быть причиной противоречивости результатов анализа корреляций генотипа и фенотипа при RTT. Эти исследования до сих пор не потеряли свою актуальность, поскольку позволяют прогнозировать развитие признаков заболевания на основании знания мутации гена МЕСР2. Кроме того, в ряде случаев идентичные мутации вызывают различные клинические проявления. Например, женщина с небольшими нарушениями обучения может иметь ту же МЕСР2 мутацию, что и ее сестра с RTT. В основе фенотипических различий в таких случаях лежат особенности Х-инактивации у индивидуумов. Х-инактивация приводит к определенному соотношению популяций нейронов с нормальным и мутантным аллелями гена МЕСР2 на активной хромосоме Х. Отсутствие развернутой клинической картины RTT обусловлено «благоприятным» сдвигом Х-инактивации [Hoffbuhr et al., 2001; Zappella et al., 2001; Shahbazian, Zoghbi, 2002; Weaving et al., 2003]. Наиболее полно исследования инактивации хромосомы Х при данном заболевании представлены в работе Юрова И.Ю. с соавторами [2005 б], в которой показано, что феномен неравной инактивации хромосомы Х является характерной особенностью RTT. При этом неравная Х-инактивация является определяющим клинический полиморфизм синдрома фактором, а течение болезни зависит от направления сдвига Х-инактивации. Различия особенностей Х-инактивации не всегда объясняют фенотипическую вариабельность между индивидуумами с RTT и одной и той же мутацией. Было показано, что значительный вклад в нее вносят гены-модификаторы, связанные с MECP2 общими патогенетическими путями. Например, частый у здоровых индивидуумов полиморфизм гена BDNF (одного из генов-мишеней для MECP2) коррелирует с предрасположенностью к судорожному синдрому и с его тяжестью при RTT [Zeev et al., 2009].

Корреляции генотипа и фенотипа исследовались нами у 74 детей с RTT: 2х мальчиков и 72-х девочек. Средний возраст детей составил 47 месяцев, варьируя от 12 месяцев до 10 лет 4 месяцев. Для статистического анализа данных об экспрессивности клинических признаков у детей с RTT, полученных при помощи разработанной клинической шкалы, нами использовался тест непараметрического сравнения независимых выборок Манна – Уитни, поскольку распределение этих данных не соответствовало критериям нормального (гауссовского) распределения. Использование t-теста было возможным только для статистической обработки результатов суммарной оценки фенотипа в баллах, поскольку их распределение было гауссовским. Проведен анализ зависимости клинической формы и тяжести течения RTT от 1) типа мутации, 2) позиции мутации в данном гене, 3) особенностей инактивации хромосомы Х. Данные о мутациях, особенностях инактивации хромосомы Х, клинической форме заболевания и суммарной оценке фенотипа в баллах у детей с RTT представлены в табл. 22. Для анализа влияния типа мутации на тяжесть течения заболевания были исследованы две группы детей с мутациями гена МЕСР2. В первую группу вошли пациенты, у которых обнаружены нонсенс мутации и мутации со сдвигом рамки считывания. Поскольку оба упомянутых типа мутаций приводят к сходным последствиям для структуры белка – синтезу укороченной полипептидной цепи, дети с данными двумя типами мутаций были объединены в первую группу. Во вторую группу вошли дети с миссенс мутациями, которые ведут к замене одной из аминокислот в белке.

Таблица 22

Мутации гена MECP2, инактивация хромосомы Х и особенности фенотипа (клиническая форма заболевания и суммарная оценка фенотипа в баллах) у больных с RTT

Примечания: * – мальчики с классической формой RTT;

** – конкордантные близнецы с RTT.

Для каждого отдельно взятого симптома RTT, оцененного по предлагаемой шкале, была обнаружена следующая закономерность: среди больных с максимальной экспрессивностью признака преобладали дети с нонсенс мутациями и мутациями со сдвигом рамки считывания, в то время как среди больных с низкой экспрессивностью признака чаще встречались дети с миссенс мутациями. Например, у больных с тяжелой микроцефалией (80 %) обнаруживались нонсенс мутации и мутации со сдвигом рамки считывания (80 %), и, напротив, у детей без микроцефалии обнаружены миссенс мутации (63 %) гена МЕСР2. Все дети, у которых наблюдались частично сохранные речевые навыки, включая отдельные слова и фразы из двух слов, имели миссенс мутации, в отличие от больных с полным отсутствием речи, у 100 % которых были обнаружены нонсенс мутации и мутации со сдвигом рамки считывания (рис. 38). В первой группе больных (с нонсенс мутациями и мутациями со сдвигом рамки считывания) суммарная оценка фенотипа в баллах (44,6 балла), следовательно, течение заболевания было статистически достоверно тяжелее по сравнению с детьми второй группы с миссенс мутациями (33,8 баллов, t = 4,031, p < 0,001). Делеции, расположенные на 3′ конце гена МЕСР2, составляют особую группу мутаций, которые не затрагивают основных функциональных доменов белка МЕСР2 и обычно приводят к клинически легким формам RTT, хотя формально они в большинстве своем являются мутациями со сдвигом рамки считывания. Поэтому, чтобы избежать противоречия, случаи делеций на 3′-конце гена были исключены из анализа влияния типа мутации на фенотип (табл. 23).

Рис. 38. Соотношения количества детей с нонсенс мутациями и мутациями со сдвигом рамки считывания (1-й группы) и миссенс мутациями (2-й группы) в зависимости от экспрессивности клинических признаков: микроцефалия, нарушения экспрессивной речи

Как видно из табл. 23, проведенный анализ продемонстрировал достоверные различия между группами индивидуумов с миссенс мутациями и больных с нонсенс мутациями и мутациями со сдвигом рамки считывания (за исключением делеций на 3′-конце гена)
по экспрессивности четырнадцати клинических симптомов и суммарной оценке фенотипа. Обнаружены статистически значимые различия между группами по таким признакам, как нарушение контакта (р < 0,05), нарушение эмоционального общения (р < 0,05), расстройства понимания обращенной речи (р < 0,05) и экспрессивной речи (р < 0,01), нарушение внимания (р < 0,05), нарушение вертикализации (р < 0,05), ходьбы (р < 0,05), преодоления препятствий (р < 0,05), расстройства вегетативных функций (р < 0,05), оро-моторных функций (р < 0,01), апраксия движений рук (р < 0,01), стереотипии (р < 0,05), спастичность мышц конечностей (р < 0,05), бруксизм (р < 0,05), сколиоз (р < 0,05).

Таблица 23

Сравнение экспрессивности клинических признаков у детей с миссенс мутациями (N = 24) и детей с нонсенс мутациями, мутациями со сдвигом рамки считывания за исключением делеций на 3′-конце гена MECP2 (N = 36) c использованием критерия Манна-Уитни для двух независимых выборок

Примечания: * р < 0,05; ** р < 0,01.

При использовании разработанной нами клинической шкалы было показано, что фенотип больного с RTT зависит от типа мутации и является более тяжелым при нонсенс мутациях и мутациях со сдвигом рамки считывания по сравнению с миссенс мутациями. При этом можно выделить симптомы, экпрессивность которых наиболее зависит от типа мутации: это нарушения экспрессивной речи, статических (вертикализации) и оро-моторных функций (жевания и глотания), а также целенаправленных движений рук. Вопреки результатам предшествующих работ, зависимости таких дыхательных нарушений, как апноэ и гипервентиляция от типа мутации в наблюдаемой группе детей не обнаружено.

Поскольку различные домены белка MECP2 выполняют различные функции, то фенотипические проявления могут зависеть от позиции мутации в гене MECP2 [Vorsanova et al., 2004]. В нашей работе был проведен анализ экспрессивности заболевания в зависимости от позиции мутации в гене (рис. 39). Обнаружено, что наибольшая тяжесть течения заболевания наблюдается у больных с мутациями, локализованными между 473 и 808 нуклеотидами кодирующей области гена МЕСР2, что соответствует 158–270 аминокислотным остаткам белка. Наиболее тяжелые клинические проявления имели дети с мутациями R168X (локализована между доменами), R255X и R270X (в TRD-домене), наименьшую тяжесть течения болезни – дети
с мутациями R133C (в MBD-домене), мутациями, расположенными ближе к 3′-концу гена – R294X, R306C, и делециями на 3′-конце, что соответствует результатам ряда ранее проведенных зарубежных исследований [Cheadle et al., 2000; Weaving et al., 2003; Neul et al., 2008]. На основании оценки фенотипа по предлагаемой в нашей работе шкале, можно было предположить тип мутации, а иногда и конкретную мутацию у ребенка с RTT. Действительно, у детей с высокой балльной оценкой по шкале – более 45 – выявлялись такие мутации из числа рекуррентных, как R168X, R255X и R270X, а у больных с низкой балльной оценкой – мутации R133C, R294X и R306C.

Рис. 39. Оценка зависимости тяжести течения синдрома Ретта от позиции мутации

Классическая форма заболевания наблюдалась при большинстве обнаруженных мутаций гена MECP2, что было в значительной степени обусловлено строгим клиническим отбором больных для данного исследования. Вариант RTT c сохранной речью установлен у 2-х детей с одинаковой мутацией – R306C. Ранее некоторыми авторами также обращалось внимание на связь этой формы болезни с мутацией R306C, которая нами подтвердилась [Zappella et al., 2001]. Стёртая форма синдрома (forme fruste) отмечалась при мутациях S65X (1 случай), R133C (2 случая), R250fs (1), R294X (1), R306С (1) и делеции 356del92 (1), так же как и в зарубежных исследованиях [RettBASE, IRSF MECP2 Variation Database]. Таким образом, установленные нами у детей с мутациями гена MECP2 клинические формы заболевания совпадали с наблюдавшимися другими авторами при тех же мутациях. Исключение составила классическая форма RTT у мальчика с соматическим мозаицизмом по мутации R168X, которая не выявлялась ранее.

У девочки 4х лет с «RTT-подобным» фенотипом обнаружена миссенс мутация T197M, вызванная заменой цитозина на тимин в положении с.590 и расположенная в четвертом экзоне между MBD и TRD. На основании положения данной миссенс мутации ранее предполагалось, что она не имеет функциональных последствий [Hoffbuhr et al., 2001; Laccone et al., 2002], в то же время другими исследователями была показана связь данной мутации с атипичной формой RTT [Bourdon et al., 2003; Shibayama et al., 2004]. В международной базе данных RettBASE по мутациям гена MECP2 содержатся упоминания о нескольких случаях выявления данной мутации: 2 случая у больных с RTT, 1 – с аутизмом, 1 – с умственной отсталостью. Суммируя литературные данные о мутации T197M, и учитывая то, что она была обнаружена в данной работе у девочки с RTT-подобным фенотипом, можно предположить, что эта мутация является причиной определённого субфенотипа синдрома.

Рис. 40. Зависимость тяжести течения синдрома Ретта от степени сдвига Х-инактивации. Показано уменьшение доли детей с тяжелыми и возрастание больных с лёгкими формами RTT при увеличении сдвига Х-инактивации

Для изучения влияния инактивации хромосомы Х на тяжесть фенотипических проявлений болезни дети были разделены на три группы: с легким течением (10 детей), у которых суммарная оценка фенотипа в баллах составляла менее 30, со средней тяжестью фенотипических проявлений заболевания (19 больных) с суммарной оценкой от 30 до 44 и тяжелым течением болезни (9 больных) с суммарной оценкой более 44 баллов. По степени сдвига инактивации хромосомы Х детей также разделили на три группы: первая – от 50 до 65 (12 детей); вторая – от 66 до 80 (14 детей); третья – более 80 (11 детей). На рис. 40 показана зависимость легкого, среднего и тяжелого течения RTT от различной степени сдвига Х-инактивации. Видно, что среди детей из первой группы с отсутствием сдвига Х-инактивации половина представлена больными с тяжелым течением заболевания. Среди девочек, составляющих вторую группу со сдвигом Х-инактивации 66–80 %, бóльшая часть имеет среднетяжёлую форму синдрома. В третьей группе со сдвигом Х-инактивации более 80 % у основной массы детей наблюдались лёгкие формы болезни. Таким образом, сдвиг инактивации хромосомы Х у детей с RTT в большинстве случаев приводил к более лёгкому течению заболевания, чем у девочек с равной Х-инактивацией, вероятно, из-за преимущественной инактивации хромосомы Х с мутацией. Полученные результаты противоречат тем ранее опубликованным, в которых не было выявлено статистически значимой связи тяжести течения заболевания с типом и позицией мутации [Amir et al., 1999; Huppke et al., 2000; Hoffbuhr et al., 2001], но согласуются с работами, в которых она была показана [Юров и др., 2007; Colvin et al., 2004; Bebbington et al., 2008].

Индивидуальный анализ мутации гена MECP2 и особенностей инактивации хромосомы Х у ребёнка с RTT даёт возможность прогнозировать тяжесть течения заболевания, что наблюдалось в нашем исследовании. Ниже представлены примеры индивидуального анализа корреляции мутации гена MECP2 и особенностей инактивации хромосомы Х с тяжестью клинических проявлений при RTT. Наибольший интерес представлял данный анализ у наблюдавшихся нами близнецов с RTT, фенотип которых представлен на рис. 41.

Краткое клиническое описание случая RTT у близнецов. Родители близнецов не имели родственников с подтвержденной наследственной патологией, брак неродственный. Первая девочка из пары близнецов родилась в головном предлежании с массой тела 1800 г, длиной тела 43 см, окружностью головы 31 см. Оценка по шкале Апгар была 4/7. Первоначально психомоторное развитие девочки было нормальным: уверенно держала голову к 3 мес., хорошо брала предметы и манипулировала ими к 5 мес., сидела с 8 мес., ходила с 16 мес., использовала несколько слов с 8 мес., к году владела 10–12 словами. На втором году жизни развитие приостановилось. В 18 мес. общение и речь стали ухудшаться. К 24–26 мес., утратила целенаправленные движения рук, но сохранила способность ходить. С 2,5 лет появились стереотипии в виде стискивания ладоней. В 3 года – не говорила, выявлялась микроцефалия – окружность головы – 47 см (3й перцентиль). Целенаправленные движения рук были заменены на стереотипные. Отмечались стопы малого размера с вазомоторными нарушениями. Девочка стояла с поддержкой, но не ходила. Были выражены гипотония мышц и умственная отсталость. В 5 лет состояние ребенка ухудшилось: отмечен кифосколиоз, приступы гипервентиляции, пирамидные нарушения, бруксизм. В отличие от сестры-близнеца, она не имела судорог. В целом следует отметить более позднюю манифестацию большинства клинических признаков у (1) по сравнению с (2). Вторая девочка из пары близнецов родилась в тазовом
предлежании с массой тела 1700 г, длиной тела 42 см, с окружностью головы 30 см. Оценка по шкале Апгар была 3/7 баллов. Со слов родителей она начала держать голову к 3 мес., сидела с 9 мес., ходить начала с 18 мес. К году говорила 4–5 слов. Девочка хорошо удерживала и манипулировала предметами, активно общалась и играла. В возрасте 12 мес. перестала произносить новые слова, а в 17мес., после бронхита ухудшился контакт ребенка с окружающими, стал очевиден регресс речевых навыков. Однако девочка стала самостоятельно, но неустойчиво ходить. Родители сообщают об утрате целенаправленных движений рук, нарушении сна и приступах немотивированного крика в возрасте 20 месяцев. К 2 г 2 мес. она утратила навык ходьбы. В это же время появились стереотипные движения в виде стискивания ладоней и стучания дорсальной поверхностью кистей по зубам. При обследовании в трехлетнем возрасте больная имела хороший эмоциональный контакт с родителями, развитие ее было на уровне ребенка в возрасте 10 мес. Выявлялась микроцефалия – окружность головы – 47 см (менее 3х перцентилей), выраженная диффузная гипотония мышц. Обращал на себя внимание малый размер стоп, а также вазомоторные расстройства в дистальных отделах ног. Целенаправленные движения рук отсутствовали, наблюдались стереотипии, периодически возникало сходящееся косоглазие. Несколько раз в неделю отмечались абсансы и кратковременные фокальные судороги. При осмотре в возрасте 5 лет отмечен кифосколиоз, пирамидные расстройства, пароксизмы гипервентиляции. В этом возрасте близнецы были помещены в интернат для детей с умственной отсталостью, где вторая девочка умерла в 8-летнем возрасте во время эпилептического приступа.

Рис. 41. Фенотип близнецов с синдромом Ретта и мутацией R255X гена MECP2

У двух близнецов с классической формой RTT определена одинаковая нонсенс мутация R255X, тогда как у их матери данная мутация не была обнаружена. Анализ инактивации хромосомы Х у первой девочки выявил значительный сдвиг Х-инактивации (80:20), у второй – равную Х-инактивацию (56:44), у матери Х-инактивация составила 77:23. Сдвиг Х-инактивации у матери не является значительным, поэтому носительство ею МЕСР2 мутации было исключено. Обнаружена также одинаковая длина полиморфного участка ЦАГ-повторов в гене андрогенного рецептора (AR) у обеих девочек, что вместе с наличием одинаковой МЕСР2 мутации дало основание полагать, что эти близнецы являются монозиготными. Мутация R255X гена МЕСР2 приводит к потере основных функций белка МEСР2 и в большинстве случаев – к очень тяжелому течению синдрома [Bebbington et al., 2008]. Однако нами наблюдалось более легкое течение заболевания у девочки со сдвигом Х-инактивации, чем у девочки с равной инактивацией хромосомы Х. Об этом свидетельствует то, что количественная оценка клинических проявлений RTT была 49 баллов у первой и 57 баллов у второй девочки. Регресс, появление стереотипий и утрата целенаправленных движений рук у девочки с неравной Х-инактивацией появились позже, чем у сестры, а также у неё не наблюдалось судорог, тогда как у девочки с равной Х-инактивацией судорожный синдром имел крайне тяжелое течение, что привело к её смерти в возрасте 8 лет (табл. 24).

Таблица 24

Сравнительной анализ тяжести течения RTT у монозиготных близнецов с мутацией R255X

Результаты обследования данной семьи свидетельствуют о том, что при преимущественной инактивации мутантной хромосомы Х может наблюдаться более легкое течение болезни. В то же время нами наблюдалась еще одна семья, в которой близнецы страдали RTT и имели одну и ту же мутацию – R270X. У этих девочек практически не было различий в тяжести течения болезни и сроках её манифестации (рис. 42). У обеих девочек стадия регресса началась в 1 г 2 месяца, в возрасте 4 года суммарная оценка фенотипа составила 44 и 45 баллов, а Х-инактивация носила случайный характер.

Рис. 42. Фенотип близнецов с синдромом Ретта и мутацией R270X: слева девочки в возрасте 13 месяцев перед началом стадии регресса; справа – близнецы в возрасте 4х лет во время псевдостационарной стадии болезни

Особенности Х-инактивации имеют значительное влияние на формирование фенотипических признаков при RTT. При сдвиге Х-инактивации против хромосомы Х без мутации будет наблюдаться более тяжелое течение болезни. Так, у одной из больных с классической формой синдрома обнаружена мутация R168X и сдвиг Х-инактивации 90:10 против материнской хромосомы Х. Анализ Х-инактивации у матери девочки показал её случайный характер. В данном случае, по-видимому, инактивирована немутантная хромосома Х, что объясняет тяжелую форму болезни у ребенка (суммарный показатель оценки тяжести фенотипа – 46 баллов). Суммируя полученные данные, следует заключить, что существуют корреляции типа и позиции мутации гена МЕСР2, а также особенности инактивации хромосомы Х с тяжестью течения RTT и экспрессивностью его отдельных признаков. Полученные корреляции генотип/фенотип помогают понять основы клинического полиморфизма RTT и предположить тяжесть течения болезни ребенка уже в раннем возрасте (табл. 25). Система прогнозирования тяжести состояния ребёнка с RTT должна основываться на исследовании мутаций гена MECP2 и знании о влиянии конкретных мутаций на тяжесть фенотипических проявлений, а также на определении особенностей инактивации хромосомы Х. При этом следует учитывать то, что сдвиг Х-инактивации против мутантной хромосомы Х может облегчать течение болезни, а сдвиг Х-инактивации против нормальной хромосомы Х может делать его более тяжёлым.

Система прогнозирования тяжести течения синдрома FRAXA также предложена нами. Анализ зависимости фенотипа индивидуумов из семей с синдромом FRAXA от наличия мутации/премутации гена FMR1 и особенностей инактивации хромосомы Х проведен в 27 семьях с данной патологией. Для этого сравнивались фенотипы двух групп детей:

1) мальчиков, у которых определена мутация гена FMR1 (27 пациентов),

2) мальчиков с недифференцированной умственной отсталостью, аутизмом и фенотипическими признаками, напоминающими синдром FRAXA, у которых определено нормальное число триплетных повторов в промоторе гена FMR1 (41 пациент).

Таблица 25

Прогнозирование тяжести течения синдрома Ретта на основе определения мутации гена MECP2 и анализа инактивации хромосомы Х

Дети были обследованы с помощью ранговой шкалы, разработанной для количественной оценки степени тяжести клинических симптомов заболевания. Результаты суммарной оценки фенотипа детей по клинической шкале, данные о регрессе психического развития, случаях ранней менопаузы и синдрома тремора и атаксии у родственников I–II степеней родства представлены в табл. 26.

Таблица 26

Результаты клинического обследования больных с синдромом FRAXA и детей с недифференцированными формами умственной отсталости и аутизма, а также их родственников

Анализ данных, представленных в табл. 26, показал, что суммарная балльная оценка по клинической шкале у детей с синдромом FRAXA была статистически достоверно выше, чем у больных с недифферецированными формами умственной отсталости (критерий Манна-Уитни, p < 0,001). Кроме того, в анамнезе у детей с синдромом FRAXA, в отличие от больных с недифференцированными формами умственной отсталости и аутизма, не встречалось регресса психического развития, а случаи преждевременного нарушения функции яичников у женщин наблюдались только в родословных детей с синдромом FRAXA. Для того чтобы определить, какие признаки (особенности фенотипа, течения заболевания) отличают больных с мутацией от детей без таковой
проведено сравнение экспрессивности клинических симптомов у данных групп индивидуумов с помощью непараметрического теста Манна-Уитни для двух независимых выборок (табл. 27). Определены статистически значимые различия между двумя группами детей по тяжести следующих признаков: зрительный и тактильный контакт, тахилалия (ускоренный темп речи), речевые персеверации и эхолалия, специфические стереотипные движения в виде «встряхивания кистей», комплекс лицевых микроаномалий (удлиненная форма лица, загнутый вниз кончик носа, крупные оттопыренные ушные раковины, выступающий лоб и подбородок), макроорхизм, аномалии соединительной ткани (гиперрастяжимость кожи, гиперподвижность суставов, плоскостопие) и увеличение окружности головы. Перечисленные признаки были в большей степени выражены у детей с синдромом FRAXA. Признаки, наблюдавшиеся у женщин-родственниц пробанда с мутациями и премутациями гена FMR1, представлены в табл. 28.

Таблица 27

Сравнение экспрессивности клинических признаков, выраженной в баллах, у детей с синдромом FRAXA (N = 27) и детей с недифференцированной умственной отсталостью и аутизмом (N = 41) с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни

Примечания: *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.