Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

8.1. Исследования хромосомного мозаицизма в группе детей с аутизмом

Оригинальные исследования хромосомного мозаицизма у детей с аутизмом проводились в группе из 116 детей (все мальчики), из них все соответствовали критериям аутизма по общепринятым шкалам. Контрольной группой послужили 60 здоровых детей. Все эти дети были обследованы стандартными цитогенетическими методами. Кариотипы детей в обеих группах были нормальны. Затем с целью обнаружения стохастической (фоновой) анеуплоидии хромосом была проведена 3-цветовая флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) с зондами
на 6 случайно отобранных аутосом и половых хромосом (гоносом). Многие исследователи предполагают (Iоurоv et al., 2006б; 2010 а; Iоurоv, 2012; Yurov et al., 2007; Vorsanova et al., 2010 б, в, г), что мозаичная анеуплоидия – относительно частое явление при различных генетических заболеваниях, в том числе при заболеваниях аутистического спектра; тем не менее, «скрытый» хромосомный дисбаланс, в том числе хромосомный мозаицизм малого уровня, до наших исследований был недостаточно изучен. При этом, высокотехнологичные методы молекулярной цитогенетики, в частности, СGH и FISH, ранее мало использовались для изучения идиопатического аутизма. Предполагается, что хромосомные аномалии и различные генетические и эпигенетические механизмы, ведущие к возникновению соматического мозаицизма, могут вызывать малые изменения экспрессии генов, что, в свою очередь, способствует развитию патологии, в том числе поражению центральной нервной системы и её высших психических функций.

У всех детей с идиопатическим аутизмом и в контрольной группе проанализировано > 420000 клеток (Yurov et al., 2007). В результате была определена средняя частота стохастической анеуплоидии при аутизме и в контроле:

1) потеря аутосом – 0,6 % (0,37–0,83 %) и 0,58 % (0,42–0,75 %), соответственно;

2) дополнительные (сверхчисленные) аутосомы – 0,22 % (0,14–0,3 %) и 0,15 % (0,09–0,21 %), соответственно;

3) дополнительная (сверхчисленная) хромосома Х – 1,01 % (0,85–1,17 %) и 1,11 % (0,9–1,31 %), соответственно.

Частота мозаичной анеуплоидии выше фонового уровня была обнаружена у 19 из 116 детей (16,4 %) с идиопатическим аутизмом, а в контрольной группе не было ни одного случая превышения фонового уровня. В частности, было обнаружено 8 случаев дополнительных хромосом 9 и 15 и потери хромосом 15, 16 и 18, а также 11 случаев дополнительной хромосомы Х (дисомия Х). Все эти случаи были классифицированы как мозаицизм низкого уровня. Анеуплоидия низкого уровня хромосом 1, 17 и Y не была выявлена, что означает: мозаичная анеуплоидия при аутизме хромосомоспецифична, и всего чаще встречается в виде дополнительной хромосомы Х. Установленная частота случаев мозаичной анеуплоидии (16,4 %) у детей с аутизмом заметно отличалась от этого показателя в контрольной группе (0 %). Уровень стохастических потерь, приобретения аутосом и дополнительной хромосомы Х был примерно одинаков в обеих группах. Поиск анеуплоидии с помощью FISH также позволил осуществить детекцию анеуплоидии в метафазных клетках, но было
затруднительно проанализировать репрезентативное количество метафазных пластинок для точной статистической оценки всех случаев аутизма, поскольку анализ стандартного числа метафаз (n = 20–30) не позволял доказать наличие хромосомного мозаицизма в изученных группах. Лишь только в случае трисомии 9 малого уровня, выявленной интерфазной FISH (2,1 % при пороговом уровне 0,5–0,9 %), было обнаружено, что во всех трисомных метафазных пластинках (4 из обследованных 120) содержалась изменённая дополнительная хромосома 9 (der(9) (рter->9q32:). Ещё в одном случае малопроцентной мозаичной трисомии хромосомы 15 (частота 1,2 %, пороговый уровень 0,5 %) выявлена клеточная линия со сверхчисленной хромосомой der(15). Эта маркерная хромосома, дериват хромосомы 15, была выявлена в 3 метафазах при анализе 100 метафазных пластинок. Эти 2 случая показывают, что при поиске мозаичной анеуплоидии низкого уровня методом интерфазной FISH необходима достаточная аккуратность с подсчётом не менее 500 ядер, чтобы обнаружить даже малую долю аномальных клеток (< 3 % клеток с дополнительными хромосомами). В противоположность этому, малопроцентный мозаицизм 47,XXY/46,XY обнаруживался как в метафазах, так и при анализе интерфазных ядер, и это позволило подтвердить факт малопроцентного мозаицизма. Разница между показателями метафазного и интерфазного анализа могла возникнуть либо из-за разного числа проанализированных клеток, либо из-за неспособности
анеуплоидной клеточной линии выживать столь же хорошо в процессе культивирования, как и нормальной.

Известно, что соматический хромосомный мозаицизм часто наблюдают у человека (Юров и др., 2004; 2010; 2014; Ворсанова и др., 2006; 2008; 2010; Юров и др., 2007, 2010 а, б; Тиганов и др., 2012; Васин и др., 2015; Yurov et al., 2001; Iourov et al., 2006 a, б; 2008 б, г). Мозаичная анеуплоидия хромосом отмечена у 50 % преимплантационных эмбрионов человека, 25 % спонтанных абортусов и 1–2 % жизнеспособных беременностей (плодов). Уменьшение доли таких клеток в онтогенезе указывает на значительный отбор против анеуплоидных клеток. Снижение прессинга (отбора) может вести к выживанию мозаичной клеточной популяции. Межклеточные хромосомные вариации, вызываемые стохастическими ошибками в «механике» митоза, могут наблюдаться практически во всех клеточных линиях. Однако общих данных об этом явлении мало, так как нет общепринятых унифицированных подходов к идентификации реального мозаицизма малого уровня. Наиболее эффективным методом для его обнаружения является, вероятно, интерфазная FISH, когда анеупдлоидию можно распознать при < 1 % анеуплоидных клеток в общей
клеточной популяции. Хромосомный мозаицизм можно анализировать и с помощью других технологий, но, вероятно, с меньшей эффективностью по сравнению с интерфазной FISH. Например, аrrаy СGH может выявлять хромосомный мозаицизм только при 15–30 % аномального клеточного контента. В этом контексте становится очевидной значимость разграничения между фоновым и патогенным уровнями мозаичной анеуплоидии, как необходимого условия систематических исследований соматического мозаицизма в норме и патологии (Yurov et al., 2007).

Пример FISH с зондами на хромосомы X и Y у ребёнка с идиопатическим аутизмом и мозаицизмом по хромосоме Х показан на рис. 7. На рисунке видна клетка с нормальным числом гоносом (справа) и с дисомией хромосомы Х (слева) у мальчика 6 лет.

Рис. 7. Флюоресцентная гибридизация (FISH) с центромерными ДНК зондами на хромосомы X и Y у мальчика 6 лет с идиопатическим аутизмом

Как видно, у ребёнка с аутизмом выявлена дополнительная (сверхчисленная) хромосома Х, и данный пациент является носителем мозаичной анеуплоидии по хромосоме Х, так как такие клетки обнаружены у этого ребёнка в определённой доле, превышающей стохастический уровень (6,2 %).

Наличие мозаичных хромосомных аномалий у детей с аутизмом описывается в виде структурных хромосомных аномалий и маркерных хромосом в довольно значительной доле клеток, в то время как случаи идиопатического аутизма, ассоциированные с малопроцентным мозаицизмом в виде анеуплоидии хромосом, ранее не описывались. Это может быть объяснено тем, что обычно при изучении аутизма применялись либо стандартные цитогенетические методы, либо СGH, менее эффективные при изучении мозаицизма низкого уровня (при доле мозаичного клона в 5–6 % СGH может такой клон не выявить, да и при стандартном цитогенетическом исследовании обычно анализируют 20–30 клеток, и малый аномальный клон может быть не обнаружен). Более того, нет и общепринятых критериев определения мозаицизма в соматических тканях человека. Следовательно, для определения хромосомного мозаицизма прежде всего необходимо установить критерии его оценки. Представленные нами данные впервые ясно указывают на то, что малопроцентный хромосомный мозаицизм случается с высокой частотой у детей с идиопатическим аутизмом, и это заставляет думать, что такой вид мозаицизма действительно имеет клинические проявления.

«Скрытый» хромосомный мозаицизм у детей с задержкой психоречевого развития неясного генеза не был подвергнут всесторонней оценке, в основном, из-за трудностей идентификации. Интересно провести параллель с другим типом малых хромосомных дисбалансов, что также затруднительно в обнаружении обычными цитогенетическими методами, а именно с субтеломерными делециями и дупликациями. Эти аномалии встречаются с частотой в 6–7 % у детей с умственной отсталостью неясного происхождения. Из литературы известна работа, где было исследовано до 2500 индивидуумов с умственной отсталостью, и встречаемость субтеломерных перестроек оказалась около 5 %. Но, с другой стороны, 2 независимых исследования субтеломерных перестроек в группах из 104 и 72 пациентов с аутизмом не обнаружили субтеломерных дисбалансов, что предполагает незначимую ассоциацию с аутизмом. Тем не менее, аrrаy СGН показывает наличие «скрытых» хромосомных перестроек (но не субтеломерных или мозаичных перестроек хромосом) при заболеваниях аутистического спектра. Исследования хромосомного мозаицизма низкого уровня могут быть более успешны, так как межклеточные хромосомные вариации могут приводить к формированию весьма разнообразных фенотипов, как это бывает при аутизме и умственной отсталости. Мы полагаем, что исследования «скрытого» мозаицизма или тканеспецифичного мозаицизма при идиопатическом аутизме и умственной отсталости могут открыть новые перспективы медицинской генетики. Итак, малопроцентная мозаичная анеуплоидия может рассматриваться как новая цель диагностики при нарушениях психического развития в детстве. Ниже в таблице приводятся данные о частоте мозаичной анеуплоидии у детей с аутизмом и в контрольной группе (табл. 7).

Таблица 7

Частота мозаичной анеуплоидии у детей с аутизмом
и в контрольной группе

При рассмотрении данных, полученных при исследовании хромосомного мозаицизма в группе детей с идиопатическим аутизмом, обращает на себя внимание тот факт, что не обнаружены случаи анеуплоидии с превышением стохастического уровня по некоторым аутосомам. Это может объясняться тем, что анеуплоидии по этим хромосомам, насыщенным генами, даже в мозаичном варианте летальны для эмбрионов, и такие эмбрионы гибнут на ранних этапах внутриутробного развития. Кроме того, интересен факт отсутствия случаев превышения стохастического уровня потери хромосомы Y у мальчиков; можно предположить, что хромосома Y каким-то образом «устойчива» к потерям; возможно  также, что эмбрионы с мозаичной формой нуллисомии хромосомы Y, как и эмбрионы с моносомией хромосомы Х, маложизнеспособны и также по большей части гибнут внутриутробно на ранних сроках беременности.

Аутизм считают нарушением пренатального и постнатального развития головного мозга. Предполагается, что патогенез заболевания связан с дисфункцией гиппокампа и других связанных с ним структур коры. Также возможно участие в этих процессах некоторых структур мозжечка, ответственных за социально-когнитивные и коммуникативные функции. Крупные изменения генома, такие как потеря или приобретение целых хромосом (анеуплоидии), описаны в клетках головного мозга человека в норме и патологии. Межклеточные геномные (хромосомные) вариации в головном мозге, вполне вероятно, – механизм, лежащий в основе формирования разнообразия нейронов, а также склонности мозга к болезням. Анеуплоидии одновременно охватывают сотни или даже тысячи генов, и поэтому ведут к более драматическим изменениям в физиологии нейронов и работе мозга по сравнению с другими типами нестабильности генома. Головной мозг, в основном, состоит из постмитотических дифференцированных клеток, в том числе из 95–100 миллиардов нейронов. У типичного зрелого нейрона 5 000–200 000 синапсов. Анеуплоидный нейрон может быть интегрирован в нейронные сети и, теоретически, даже малые количества анеуплоидных нейронов могут негативно влиять на функциональную активность мозга. Это предположение согласуется с данными о том, что, по крайней мере, некоторые случаи болезни Альцгеймера и шизофрении, вероятно, ассоциированы с повышенным уровнем хромосомного дисбаланса в головном мозге (Юров и др., 2004; 2007; 2012 а, б; 2014 в; Тиганов и др., 2012; Ворсанова и др., 2013 в; Iourov et al., 2006 a, б; 2008 a, б, г). Следовательно, мозаичная анеуплоидия в головном мозге может лежать в основе патогенеза психических заболеваний. Поэтому молекулярно-цитогенетические исследования аутизма должны быть не только на лимфоцитах периферической крови, но и на постмитотических нейрональных и глиальных клетках головного мозга (Юров и др., 2010 б; 2014 в; Юров и др., 2010; Iourov et al., 2008 г; 2010 а).