Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

3. АУТИЗМ И ГЕТЕРОХРОМАТИНОВЫЕ ВАРИАНТЫ ХРОМОСОМ

Поскольку при большинстве цитогенетических исследований в группе детей с аутизмом причину патологии в виде численных либо структурных аномалий хромосом обнаруживают в 5–10 % случаев или менее, очевидна необходимость поиска других структурных и функциональных изменений генома в качестве возможной причины аутистических расстройств (Ворсанова и др., 2006; 2008; Brothman et al., 2006).

Практически завершённая программа «Humаn Genоme» («Геном человека») (Venter et аl., 2001; IHGSС, 2004) оказалась неспособна расшифровать геномные последовательности в составе конституциональных гетерохроматиновых районов хромосом человека. Наиболее сложной и значимой проблемой является ответ на вопрос о корреляции вариабельности этих участков хромосом со специфическими фенотипическими проявлениями и о сложностях в дифференцировании так называемых нормальных вариаций гетерохроматиновых участков (гетерохроматиновые или хромосомные варианты) в структуре хромосом от их патологических изменений. Морфологические вариации хромосом за счёт этих участков поднимают вопрос об интерпретации хромосомных вариантов. Для ответа на этот вопрос необходимо знать многое о «нормальных»
вариантах хромосом, что было выполнено при их изучении во многих фундаментальных работах (Прокофьева-Бельговская, 1986; Жимулёв, 1993; Ворсанова и др., 1999; 2006; Wyаndt, Tоnk, 2004; Brоthmаn et аl., 2006). Неоценимый вклад в изучение нормальных хромосомных вариантов (С-вариантов) в различных популяциях внесли публикации 70-х годов, описывающие результаты сравнения групп детей негроидной и европеоидной рас по частоте экстремальных вариантов и гетероморфизма для каждой хромосомы. С-варианты хромосом 1, 9 и 16 встречались чаще, однако варианты в виде уменьшения блоков С-гетерохроматина статистически не различались у этих двух рас, а крупные С-варианты встречались почти в 2 раза чаще у негроидов. Также наблюдались и отличия по частоте инверсий гетерохроматина (1рhqh, 1рh, 9рhqh, 9рh). При Q-окрашивании различия частот определяли для коротких плеч и спутников акроцентрических хромосом, а также для ярко флюоресцирующих вариабельных прицентромерных участков хромосом 3 и 4. Отмечена высокая частота увеличения короткого плеча хромосомы 13 в группе представителей негроидной расы. Полиморфизма других хромосом эта методика дифференциального окрашивания не выявила. Отечественными исследователями также были изучены суммарные частоты экстремальных вариантов у 6000 новорождённых с помощью С- и Q-окрашивания. Общая частота комбинаций всех вариантов составила 12,8 на 1000 новорождённых (Кулешов, Кулиева, 1979).

В целом, вариабельность гетерохроматиновых участков хромосом наблюдают:

а) при С-окрашивании – в хромосомах 1, 9, 16, 13–15, 21, 22 и Y;

б) при Q-окрашивании – в хромосомах 3, 4, 13–15, 21, 22 и Y.

Изредка могут встречаться гетерохроматиновые варианты других хромосом.

Многие группы исследователей анализировали хромосомные варианты в различных группах и популяциях. Отдельные варианты встречаются чаще в одних популяциях, чем в других, однако разная степень качества препаратов, методов окрашивания, степень конденсации гетерохроматина усложняют прямое сравнение частот вариантов хромосом, выявленных различными группами исследователей. Как правило, хромосомные варианты встречаются с частотой 1 % и выше, хотя варианты некоторых хромосом обнаруживаются крайне редко (например, варианты хромосом 8 или 20 встречаются в единичных случаях). Во многих работах отмечено увеличение частоты гетерохроматиновых вариантов при психических расстройствах, в частности, при аутизме (Ворсанова и др., 2008; Демидова и др., 2012; Кравец и др., 2014).

В проведённых в 70-е годы популяционных исследованиях часто не отмечалась зависимость уровня интеллекта от наличия Q- и С-полиморфизма, однако уже тогда стали поступать различные сообщения об увеличенной частоте С- и Q-вариантов в группах лиц со сниженным интеллектом, с шизофренией, гиперактивностью, задержкой психоречевого и психомоторного развития (Ibrаimоv et аl., 1982, 1986). Некоторые исследователи предполагали корреляцию между длиной хромосомы Y и агрессивностью поведения, основываясь на том, что при изучении больших групп мужчин – заключённых тюрем увеличение её длины отмечалось статистически достоверно чаще. Но эти предположения довольно спорны, поскольку, как показывает многолетняя цитогенетическая практика, увеличение длины хромосомы Y происходит в большинстве случаев за счёт гетерохроматинового участка в длинном плече этой хромосомы, что не так уж редко отмечается и при изучении контрольных групп, а случаи перестроек, затрагивающих эухроматиновые последовательности хромосомы Y, довольно редки и чаще сопровождаются нарушениями половой сферы пациентов при сохранном интеллекте (Демидова, Ворсанова, 1990).

Анализируя доступные литературные данные, сложно сделать однозначный вывод о возможной связи между вариациями гетерохроматиновых участков хромосом и нарушениями психики. Публикации в этой области есть, но их мало, и очевидна актуальность проведения таких исследований в различных группах, включая индивидуумов, страдающих нервно-психическими заболеваниями.

Говоря о нервных и психических заболеваниях, необходимо упомянуть и о факультативном гетерохроматине, который, в частности, формируется в случае инактивации хромосомы Х у млекопитающих (Lyоn, 1961). В определенных случаях эухроматиновые участки могут обладать некоторыми свойствами гетерохроматина. Такие участки более конденсированы по сравнению с R-сегментами хромосом, и их экспрессивная активность меньше. Описываемый феномен (называемый «феномен гетерохроматинизации») связан с тем, что ДНК эухроматина, располагаясь около гетерохроматина, может приобретать свойства последнего и, находясь в конденсированном состоянии, частично утрачивать активность. Этот процесс обратим, контролируется определёнными генами и характерен для хромосом Х, которые инактивируются почти по всей длине в раннем эмбриогенезе. Этот эпигенетический феномен в сомаических клетках женщин выравнивает количество продуктов активных генов хромосомы Х у лиц женского и мужского пола (компенсация дозы гена) при развитии тканей и органов (Ворсанова и др., 2008; Lyоn, 1961; Рlаth et аl., 2002; Сhоw, Brоwn, 2003; Heаrd, Disteсhe, 2006; Lee, 2009).

Как известно, женский кариотип содержит 2 хромосомы Х, а мужской – хромосомы X и Y. Возникает несоответствие содержания генетической информации в гоносомах организмов разных полов. У человека, как и у всех млекопитающих, такое нарушение баланса устраняется с помощью инактивации одной из хромосом Х во всех клетках женского организма. Первые предположения об этом феномене были высказаны Лайон в 1961 г. после опытов на мышах, где изучались конденсированные структуры хроматина. Этот феномен был охарактеризован как «транскрипционное молчание одной их хромосом Х у самок млекопитающих», и именно с помощью него достигается межполовая компенсация экспрессии генов хромосомы Х (Lyоn, 1961). В таких клетках образуется исключительно стабильная гетерохроматиновая структура (инактивированная хромосома Х). Мозаичная экспрессия материнских и отцовских аллелей локусов хромосомы Х отмечается у большинства лиц женского пола. В среднем, каждая из них принимает участие в экспрессии примерно в 50 % клеток, но, поскольку процесс инактивации случаен, он может значительно варьировать, что называют сдвигом Х-инактивации. Причинами сдвига инактивации считают импринтинг, структурные аномалии хромосомы Х, а также мутации Х-сцепленных генов (Оrstаvik, 2009; Аgrelо, Wutz, 2010) и мозаицизм типа 45,Х/46,ХХ. С явлением случайной, или неравной, инактивации хромосом Х в клетках женского организма ассоциируют вариации факультативного гетерохроматина и патогенез различных наследственных заболеваний. Отклонение от равного соотношения количества клеток с активной материнской или отцовской хромосомой Х и преобладание одной из клеточных популяций может вызываться мутациями хромосомы Х с последующим отбором в пользу клеток, несущих мутации в инактивированной хромосоме Х (Rаymоnd, 2006). Некоторые состояния связывают с неравной Х-инактивацией, в том числе мультифакторные заболевания (аутизм, аутоиммунные заболевания, онкологические состояния). Это эпигенетический феномен имеет большие перспективы в дальнейших научных исследованиях.

В исследованиях различных групп детей с аутизмом (Саstermаns, Wilquet,, 2004) по сравнению с общей популяцией отмечено значительное увеличение встречаемости различных хромосомных, или гетерохроматиновых вариантов, в частности таких как 1рhqh, 9qh+ и 16qh-, что, вероятно, можно рассматривать как эффект положения генов (Ворсанова и др., 2008).

В одном из ранних наших исследований проведён цитогенетический и молекулярно-цитогенетический анализ 90 детей с признаками аутизма и их 18 матерей (Ворсанова и др., 2009 а, б). Репрезентативную основную группу составили 13 девочек и 77 мальчиков. В исследуемой группе возраст варьировал в пределах от 1 до 15 лет (средний возраст – 6,5 лет), возраст матерей – от 24 до 41 года (средний возраст – 32 года). Дети, у которых наблюдались умственная отсталость, сцепленная с ломкой хромосомой Х, синдром Ретта и другие моногенные синдромы, не были включены в исследование. Умственная отсталость наблюдалась у 88 из 90 детей с аутизмом (98 %). В контрольную группу был включен 51 ребёнок без аутистических расстройств – 23 девочки и 28 мальчиков в возрасте от 1 до 15 лет (средний возраст – 5,5 лет). Диагноз «аутизм» установлен у всех пациентов на основании DSM-IV. Тяжесть симптомов оценивали количественно с помощью шкалы САRS (Sсhорler et аl., 1993), как уже отмечалось, включающей в себя анализ следующих областей: коммуникация, подражание, моторное развитие, адаптация к изменениям, игровая деятельность, зрительный контакт, реакция на тактильные и слуховые раздражители, вербальная и невербальная коммуникативная активность, эмоциональное общение, страх и нервозность, уровень активности, дезинтеграция развития разных психических сфер, общее впечатление. Тяжесть патологических проявлений оценивали от 1 до 4 баллов, после чего баллы суммировали. Состояние детей оценивалось как тяжелое. Всем исследуемым детям был проведен анализ при помощи С-окрашивания хромосом и количественной флюоресцентной гибридизации in situ (QFISH). С помощью этих методов было показано достоверное увеличение частоты вариаций гетерохроматина у детей с аутизмом по сравнению с контрольной группой (48 и 16 %, соответственно). В молекулярно-цитогенетических исследованиях применяли FISH и хромосомоспецифичные ДНК пробы, маркирующие вариабельные участки перицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, и 16. Детекция флюоресцентных сигналов проводилась с помощью системы компьютерного анализа изображения. В результате этих исследований кроме аномалий хромосом у 43 детей (48 %) также были обнаружены изменения размеров гетерохроматиновых участков в виде их уменьшения, увеличения и инверсий, среди которых 1рhqh у 6 (7 %), 9рhqh у 7 (8 %), 9qh + у 3 (3 %), 9qh- у 1 (1 %), 16qh + у 1 (1 %), 16qh- у 3 (3 %), другие варианты у 5 (6 %), сочетанные варианты у 18 (20 %). При расчётах по каждому варианту учитывались как изолированные, так и сочетанные случаи. Также цитогенетически обследованы 18 матерей, среди них гетерохроматиновые варианты хромосом выявлены у 9, причём в 5 случаях эти варианты были унаследованы их детьми. Молекулярно-цитогенетическое исследование вариантов этих хромосом с помощью QFISH полностью подтвердило данные цитогенетического анализа и позволило оценить число копий ДНК при перицентрических инверсиях с увеличенным гетерохроматиновым блоком (1рhqh+ и 9рhqh+) (Iourоv et аl., 2005).

Следует сказать о последних исследованиях гетерохроматиновых районов хромосом при аутизме, проведенных в наших лабораториях: лаборатории молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний ОСП Научно-исследовательского клинического института педиатрии ГОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, лаборатории цитогенетики и геномики психических заболеваний, а также лаборатории генетики мозга ФГБНУ Научный центр психического здоровья, которые представлены ниже.

В работе исследовали гетерохроматиновые участки (С-варианты) отдельных хромосом, выявляемые с помощью стандартного метода С-окрашивания, у 204 детей с аутизмом. У 110 пациентов из 204 обследованных (53,9 %) выявлено изменение гетерохроматиновых участков хромосом (С-вариантов), что представлено на рис. 5.

Рис. 5. Выявление С-вариантов гетерохроматина в группе детей с аутизмом

Большая доля (более половины) гетерохроматиновых вариантов в группе детей с аутизмом по сравнению с 4–6 % в общей популяции может предполагать возможное участие этих вариантов в патогене-
зе аутизма.

Всего нами выявлено 189 вариантов (0,92 варианта на индивидуума). Изолированные варианты были обнаружены в 81 случае (39,7 %). Сочетанные варианты обнаружены в 52 случаях (25,5 %). Наиболее часто встречающиеся варианты (изолированно и в сочетании с другими) представлены в таблице ниже (табл. 5).

Удельный вес различных гетерохроматиновых вариантов (изолированных и сочетанных) представлен на рис. 6 (проценты вычислены от числа случаев с вариантами хромосом – n = 110).

Таблица 5

Наиболее часто встречающиеся гетерохроматиновые варианты (изолированные и сочетанные) в группе детей с аутизмом

Рис. 6. Удельный вес отдельных гетерохроматиновых вариантов
в группе детей с аутизмом (n = 110)

При изучении разнообразия гетерохроматиновых вариантов обращает на себя внимание преобладание околоцентромерных инверсий гетерохроматина хромосом 1 и 9 (следует отметить, что инверсии околоцентромерного гетерохроматина хромосомы 16 не встречаются вообще), как изолированно, так и в сочетании с другими гетерохроматиновыми вариантами. Это может указывать на возможную патогенность этих инверсий благодаря гетерохроматинизации участков эухроматина вблизи точек разрыва при инверсиях эухроматина по сравнению с вариантами в виде увеличения либо уменьшения размеров блоков С-гетерохроматина и вариантами в виде увеличения коротких плеч акроцентрических хромосом, их спутников и спутничных нитей.

Полученные результаты по гетерохроматиновым вариантам хромосом позволяют заключить, что:

а) частота гетерохроматиновых вариантов в когорте детей с аутизмом более чем в 9 раз превышает таковую в общей популяции;

б) чаще всего встречаются варианты в виде перицентрических инверсий околоцентромерного гетерохроматина хромосом 1 и 9, как изолированные, так и сочетанные;

в) значительное увеличение частоты гетерохроматиновых вариантов может быть фактором риска в данной группе;

г) эти данные позволят проводить более эффективное медико-генетическое консультирование семей с аутизмом.

Увеличение числа вариантов гетерохроматиновых участков в группе детей с аутизмом по сравнению с контролем (53,9 % по сравнению с общей популяцией – 4–6 %) можно объяснить следующим:

1) гетерохроматиновые варианты могут быть цитогенетическим маркёром аутизма из-за возможного эффекта положения генов;

2) эпигенетическое влияние на геном могут оказывать варианты околоцентромерного гетерохроматина в виде его инверсий, так как при них расположенные вблизи с гетерохроматином участки кодирующих последовательностей эухроматина могут быть подвержены гетерохроматинизации, что может нарушать нормальную экспрессию генов в этих участках хромосом (Iоurоv et аl., 2006 а).

Следует отметить, что С-метод является косвенным для определения хромосомных вариантов, поскольку в этом методе применяется окрашивание гетерохроматиновых комплексов «ДНК-белок». Повышенная частота вариаций гетерохроматиновых районов – характеристика, присущая группам риска. Среди таковых – родители детей с наследственными заболеваниями, бесплодные семейные пары и другие. Особо следует отметить, что среди девочек с синдромом Ретта также с повышенной частотой встречаются хромосомные варианты (Ворсанова и др., 1998; Юров и др., 2004; Vorsanova et al., 1996; 2001 а, б; Iourov et al., 2013 а, в). Несмотря на то, что участки, граничащие с гетерохроматиновыми районами хромосом 9 и 16, до настоящего времени не были ассоциированы с аутизмом, большое количество генов, расположенных в этих участках и отвечающих за функционирование ЦНС и нормальное развитие, позволяет предположить роль этих участков в патогенезе аутизма. Кроме того, во многих исследованиях показано, что в различных когортах
с патологией или с воздействием вредных факторов окружающей среды практически всегда наблюдается увеличение встречаемости гетерохроматиновых вариантов по сравнению с общей популяцией; это может означать, что количественные и качественные изменения (инверсии) вариабельных участков конституционального гетерохроматина – один из возможных адаптационных механизмов эволюции человека либо, наоборот, фактор риска и биологический маркёр патологических состояний (Юров, 1984; 1987; Ворсанова и др., 1991; 1999; 2006; 2008; 2009 а; Юров и др., 2000; 2001; Юров, Ворсанова, 2001; Демидова и др., 2012; Iourov et al., 2005).

Таким образом, суммируя данные, представленные в работах по изучению гетерохроматиновых вариантов при аутизме, можно заключить, что измененные варианты гетерохроматина встречаются значительно чаще в группах детей с различными нервными и психическими заболеваниями по сравнению с группами здоровых детей.