Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
3.2.5. Метод латексной агглютинации
Метод латексной агглютинации (ЛА) – это иммунологический метод, основанный на агрегации модифицированных латексных частиц, происходящей вследствие афинного взаимодействия антиген-антитело.
Реакцию латексной агглютинации возможно провести несколькими способами. Различают прямую и конкурентную реакцию латексной агглютинации (в различных источниках так же встречаются названия «торможение реакции латексной агглютинации» или «обратная реакция латексной агглютинации»).
Реакцию прямой ЛА используют для определения поливалентных антигенов. Схема протекания прямой реакции латексной агглютинации показана на рис. 23.
Рис. 23. Схема протекания прямой латексной агглютинации:
а – агглютинация полимерных частиц, на которые иммобилизованы антитела, с молекулами низкомолекулярного антигена;
б – агглютинация полимерных частиц,
на которые иммобилизован антиген, с молекулами антител
При необходимости выявлять в растворе аналит антигенной природы, на полимерные микросферы иммобилизуют антитела, как это представлено на рис. 23 а. При необходимости выявлять в растворе аналит антительной природы, на полимерные микросферы иммобилизуют антигены, как это представлено на рис. 23 б.
Реакцию конкурентной латексной агглютинации используют для определения моновалентных антигенов, например, гаптенов. В этом случае антитела вступают в конкурентную реакцию со свободными антигенами и с антигенами, конъюгированными на носителе. Схема протекания обратной реакции латексной агглютинации показана
на рис. 24.
Рис. 24. Схема протекания реакции обратной латексной агглютинации:
а – в анализируемом растворе присутствует низкомолекулярный аналит, который конкурирует за сайты связывания с иммобилизованными на поверхности полимерных частиц антигенами. Антитела преимущественно связываются
со свободными антигенами с образованием низкомолекулярных;
б – а анализируемом растворе отсутствует аналит, свободные антитела связываются с иммобилизованными на поверхности полимерных частиц антигенами. Агглютинация наблюдается
Преимущества метода латексной агглютинации при скрининге наркотических веществ заключаются в следующем:
● возможность использования минимальных объемов исследуемого материала,
● возможность проведения больших партий анализов,
● быстрота проведения реакции (2–10 минут),
● простота и доступность для любых лабораторий,
● не требуется специальное оборудование и высококвалифицированный персонал,
● невысокая стоимость исследования.
Реакция латексной агглютинации считается положительной при наблюдении агглютинации микрочастиц суспензии вследствие смешивания компонентов реакционной системы. Агглютинация проявляется в слипании и осаждении полимерных частиц из первоначально стабильной суспензии. Результат латексной агглютинации выявляется простым визуальным наблюдением: раствор мутнеет или выпадает творожистый осадок белого цвета или реже – окрашенный (рис. 25).
Рис. 25. При положительной реакции на пластинках образуются видимые невооруженным глазом агглютинаты, которые затем увеличиваются в размере, а в пробирках выпадает осадок. В микропланшетах агглютинация проявляется в виде равномерного покрытия частицами поверхности лунки, тогда как в контроле на дне лунки образуется точечный латексный преципитат
При наблюдении реакции ЛА визуальным способом анализ проводят на стеклянных или полистирольных пластинках, в пробирках или 96-луночных микропланшетах с U-образными лунками, в которых смешивают равные объемы тестируемых сывороток в последовательных двукратных разведениях и латекс-теста и через определенное время (от нескольких минут до 5 часов) наблюдают реакцию.
Главное неудобство визуального наблюдения ЛА состоит в том, что часто бывает трудно точно определить конечную точку агглютинации, так как белый цвет полимерной суспензии или осадка плохо воспринимается глазом. Окрашивание латекса в голубой, красный, желтый, зеленый и другие цвета, а так же введение в микрочастицы флуоресцентных меток, позволяет преодолеть этот недостаток и облегчает наблюдение РЛА.
Результат РЛА носит только качественный характер. Для получения полуколичественных результатов (оценка степени агглютинации) используют титры. То есть количество антител в иммунной сыворотке или в других жидкостях в реакции агглютинации по выявлению антител оценивается их титром. Под титром антител понимают то наибольшее разведение сыворотки или иной жидкости, при котором реакция антиген-антитело все еще учитывается.
Для количественной оценки агглютинации применяют различные инструментальные методы. Среди них оптические методы: турбидиметрия (по изменению оптической плотности измеряют потерю интенсивности светового луча, прошедшего через суспензию частиц), нефелометрия (в этом случае анализируется интенсивность света, рассеянного под углом Q к падающему потоку; обычно, Q = 90°), сканирующая лазерная микроскопия и др.
В практике скрининга наркотических веществ используется качественный вариант метода ЛА из-за удобства и возможности проведения теста в «полевых» условиях неспециалистом. Разработаны тест-системы для определения основных групп наркотических веществ в моче [18, 19].