Научная электронная библиотека
Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания
§ 3.3. Влияние неорганической фазы
В работе [44] при возбуждении лазерным источником с длиной волны 351 нм исследована флуоресценция ДЭГ, эмали и дентина. Спектральное проявление эмали, дентина и ДЭГ были очень схожи. Тем не менее имелись и некоторые различия. Обнаружено, что при воздействии на ткани излучением с длиной волны 351 нм в спектре флуоресценции эмали, дентина и ДЭГ проявляются полосы с максимумами около 450, 490 и 530 нм. Сделано предположение о том, что флуоресценция твердых тканей зуба обусловлена не только органическим веществом, но и апатитовыми фазами. При этом для неорганического вещества, по мнению авторов, наиболее интенсивна флуоресценция в диапазоне от 400 до 500 нм. Поэтому для дентина характерно фиолетовое смещение спектра флуоресценции. А для более длинноволнового диапазона характерна наиболее интенсивная флуоресценция эмали. В пользу такого спектрального поведения также говорят результаты работ [45; 126; 127], в которых было показано, что снижение содержания минерала в эмали приводило к снижению интенсивности флуоресценции. Заметим, однако, что снижение интенсивности флуоресценции эмали при снижении концентрации кристаллов гидроксилапатитов кальция может быть обусловлено просто изменением оптических свойств эмали, например, отражающей или проникающей способности эмали.
В работе [33] при исследовании флуоресценции интактных зубов и зубов с различными стадиями кариозного процесса было также сделано предположение о влиянии на спектр флуоресценции эмали не только органической фазы, но и минеральной составляющей эмали. Для данной фазы в спектре флуоресценции соответствовала полоса с максимумом в области 450 нм. При этом при деминерализации твердых тканей зуба наблюдалось снижение интенсивности данной спектральной полосы.
В работе [43] исследована антистоксовая флуоресценция ДЭГ и прилегающих к ней раковистых слоев дентина и эмали с помощью метода многофотонной микроскопии. Как оказалось, сама ДЭГ обладает низким сигналом флуоресценции, в то время как прилегающие к ДЭГ раковистые слои дентина и эмали интенсивным свечением.
По средством регистрации антистоксового свечения с помощью многофотонного микроскопа было обнаружено, что зона контакта между эмалью и дентином может быть хорошо визуализирована в виде неровной линии, испускающей низкий сигнал флуоресценции. Дентинные канальцы были расположены параллельно плану изображения и оканчивались в непосредственной близости от ДЭГ. Они проявляли как низкий, так и высокий уровень интенсивности флуоресценции. Для эмали обнаружена переходная зона. Оболочка эмалевых призм испускала яркое свечение. Внутри призм свечение было слабым, что авторы работы связали с низким содержанием протеина. Апризматическая эмаль продуцировала однородное и более низкое по интенсивности свечение по сравнению с призматической эмалью.
Флуоресценция дентинного канальца была связана с свечением фибриллярного коллагена. В межтубулярном дентине коллагеновые волокна располагались перпендикулярно оси канальца. Низкий сигнал антистоксовой флуоресценции ДЭГ был связан с отсутствие в ней эндогенных флуорофоров, прежде всего белков, в противоположность дентину, где основными флуорофорами являются триптофан, коллаген и эластин [41]. Вместе с тем, поскольку интенсивность флуоресценции эмали и дентина оказалась сопоставимой по интенсивности, а дентин содержит во много раз больше белка, чем эмаль, авторы этой работы были вынуждены признать, что происхождение собственной флуоресценции твердых тканей зуба может иметь различную природу и включать влияния как органических, так и неорганических компонентов.
Указанные результаты действительно свидетельствуют о влиянии на спектр флуоресценции твердых тканей зубов минеральной фазы. В пользу этого, также говорит то, что эмаль на 95 %, а дентин на 70 % состоят из минеральной фазы, преимущественно из кристаллов ГАП кальция. Вместе с тем, для более подробного выяснения вопроса влияния на спектр флуоресценции твердых тканей зуба неорганической фазы, очевидно, следует провести исследования светочувствительных свойств данной фазы в чистом виде.
Состав «идеального» ГАП кальция соответствует формуле Ca10(РО4)6(ОН)2, т.е. он десятикальциевый с молярным отношением Ca/P, равным 1,67 [128]. Стехиометрические кристаллы ГАП кальция являются диэлектриками и при использованных в работе источниках возбуждения люминесцировать не должны. Однако в природе встречаются гидроксилапатиты кальция с отношением Ca/P от 1,33 до 2,0. Это может быть обусловлено, например, замещением в анионной или катионной подрешетках этих кристаллов Са на элементы с близкими свойствами (СО3, Cr, Ва, Mg, rидроксоний (Н3О+) и др.). Другой возможной причиной изменения состава гидроксилапатитов кальция является наличие вакантных мест в их кристаллической решетке. В результате светочувствительные свойства кристаллов могут измениться.
Особое внимание следует уделить карбонат замещенным кристаллам гидроксилапатитам кальция (КГАП), поскольку их концентрация в кристаллической структуре зубной эмали очень высока [65]. Кроме того, исследование КГАП кальция крайне важны еще и при исследовании процессов деминерализации зубной эмали, поскольку сопутствующей задачей является поиск неорганических материалов, которые в перспективе могли бы являться основной для стоматологических цементов и обладали бы наибольшим сродством к естественной костной ткани организма человека. Поэтому в данной работе мы подробно опишем методику синтеза карбонат замещенных кристаллов ГАП кальция, их физико–химические и светочувствительные свойства.
Методика синтеза КГАП кальция
Синтез, а также исследование физико-химических свойств КГАП кальция были выполнены сотрудниками кафедры физики твердого тела и наноматериалов ВГУ [129, 130, 132]. Образцы ГАП кальция, получали методом осаждения из раствора с различным значением рН (9, 8.5, 8, 7.5, 7) раствора на воздухе. Отличительной особенностью методики являлось использования в качестве источника кальция – яичной скорлупы птиц, что позволило получить наноразмерные порошки с высокоразвитой поверхностью. Яичная скорлупа представляет собой карбонат кальция (СаСО3), разлагающийся выше 900 °С на углекислый газ (СО2) и оксид кальция (СаО). Последний использовался для образования гидроксида кальция Са(ОН)2 и после титрования раствором ортофосфорной кислоты для получения до заданного значения рН образец оставляли на 12 ч. По истечении 24 ч образцы отжигались при температуре 400 °С и исследовались различными методами: инфракрасной Фурье спектроскопии (VERTEX V-70, BRUKER), рентгеновской дифрактометрии
(ДРОН-4) и электронной микроскопии (JSM-6380LV, JEOL).
Возможность синтеза нанокристаллических образцов ГАП кальция методом преципитации с использованием естественных источников кальция позволяет упростить процесс синтеза материала и улучшить свойства синтезируемого ГАП кальция [131]. Кроме особенностей фазовых превращений, следует отметить, что при синтезе ГАП кальция на атмосфере, наблюдается образование карбонат–содержащего гидроксилапатита из-за присутствия в воздухе СО2, что является положительным фактом при получении материалов, наиболее соответствующих естественной костной ткани [132].
Физико-химические свойства КГАП кальция
По данным рентгеноструктурного анализа все образцы представляли собой ГАП. Сравнение производилось с использованием международной базы данных
JCPDS –ICDD (с образцами № 9–432 и № 01–074–0565). В сопоставлении с микрокристаллическим образцом ГАП кальция, использовавшимся в качестве эталона, была произведена оценка размеров кристаллитов, присутствующих в полученных порошкообразных материалах, средний размер составил ~ 35 нм. Методом просвечивающей электронной микроскопии, с предварительной подготовкой образца (ультразвуковым диспергированием и нанесением материалов на углеродную сетку) было определено, что образцы КГАП кальция состоят из стержневидных нанокристаллов с диаметром ~ 20 нм и длинной 50 нм. Инфракрасная спектроскопия также использовалась для определения качественного состава синтезированного материала. Анализ экспериментальных и литературных данных показал, что основные колебательные моды, характерные для кристаллического ГАП кальция, присутствуют в спектре синтезированных образцов. Кроме того, в ИК–спектрах порошков синтезированного ГАП кальция обнаружились малоинтенсивные пики в области 879, 1415 и 1451 см–1 соотносимые с группой СО3, замещающую группу РО4 в структуре ГАП. Их появление может быть обусловлено высокой активностью исходного компонента СаО и присутствии СО2 в процессе синтеза. Метод электронного парамагнитного резонанса был использован для определения наличия дефектов в структуре ГАП. Спектры ЭПР в образцах с рН = 9; 8,5; 8; 7,5; 7, измеренные через 1 неделю после облучения образцов электронами с дозой 10 кГр. показали наличие 5 сигналов от радикалов: O–, CO2– , CO3– , CO33– и от органического радикала CH3. С помощью симуляции спектров с использованием модуля Easyspin в среде MatLab в спектрах эхо–детектирования электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) удалось выделить из перекрывающихся сигналов CO33– радикал от предцентра карбонат включенного СО32–. Методом рентгеноспектрального микроанализа (РСМА) был исследован элементный анализ полученных материалов. Элементный состав (ат. %) образцов КГАП, полученных с различными значениями рН, и отожженных при 400°С обнаружил что для КГАП (рН = 9) Са/Р = 2,04, КГАП (рН = 8,5) Са/Р = 1,89, КГАП (рН = 8) Са/Р = 1,83, КГАП (рН = 7,5) Са/Р = 1,80, КГАП (рН = 7) Са/Р = 1,77.
Полученные результаты привели к заключению о том, что изменение величины рН на ± 0,5 для полученных образцов значительно влияет на соотношение Са/Р. Метод рентгеноспектрального анализа также показал, что в образцах присутствует углерод на уровне 7–8 % ат. Но из-за погрешности метода, возникающей при количественном определении легких элементов, а также из-за наличия углерода в камере прибора изменение концентрации углерода с изменением рН устанавливается неточно. Обобщая результаты различных методов анализа, а также сведений из литературы для схожего метода получения и рН 9–7 [133] следует отметить, что доля карбонат ионов в КГАП может доходить при данных условиях получения 4–3 % вес.
Флуоресценция КГАП кальция
Исследование светочувствительных свойств синтезированных образцов КГАП кальция показало, что в отличие от беспримесного гидроксилапатита [134, 135]
КГАП кальция имеют интенсивную полосу флуоресценции с максимумом
на ~ 515 нм (см. рис. 7), соответствующей энергии перехода ~ 2,4 эВ. Причем как видно из рис. 7 интенсивность флуоресценции возрастает при увеличивающейся доли СО32– в образце, что коррелирует с данными ИК–спектроскопии [132]. В качестве источника возбуждения флуоресценции использовали лазерный диод излучающий на длине волны 405 нм.
Рис. 7. Спектр флуоресценции КГАП кальция в зависимости от уровня рH раствора
Из рис. 7 видно также, что полоса флуоресценции КГАП кальция очень хорошо коррелирует с полосами флуоресценции твердых тканей зубов (см. рис. 3, а), прежде всего по положению пика флуоресценции. Анализ литературных источников показывает, что фотолюминесценция в беспримесном ГАП может быть вызвана собственными структурными дефектами, возникающими в процессе его получения с преднамеренным и непреднамеренным модифицированием состава [134, 136]. Центром люминесценции КГАП кальция, вероятно является группа СО3, замещающая группу РО4 в структуре КГАП. Следует отметить, что в цитируемой работе [135] максимум ФЛ, обусловленный собственными дефектами беспримесного ГАП, зарегистрирован при ~3,8 эВ. Однако энергия использованного нами источника возбуждения ФЛ не позволяет наблюдать ФЛ при таких энергиях, поэтому мы оговариваем только наблюдаемую нами внутрицентровую ФЛ с максимумом при ~2,4 эВ.
Следует, конечно, учитывать возможное влияние и других замещенных кристаллов ГАП, например, Mg. В своих исследованиях мы обнаружили, что нанокристаллы гидроксилапатитов кальция, замещенных магнием, также флуоресцируют при возбуждении фиолетовым и синим источниками возбуждения, при этом спектр их флуоресценции сопоставим по форме со спектром флуоресценции твердых тканей зубов.
Таким образом, очевидно, что примесные кристаллы ГАП кальция могут вносить существенный вклад в свечение твердых тканей зубов. В пользу этого, также говорят результаты по соотношению интенсивностей свечения эмали, дентина и ДЭГ. Действительно, из рис. 3 видно, что область, прилегающая к ДЭГ обладает большей флуоресценцией по сравнению с интенсивностью свечения эмали и дентина в отдельности. Ранее в § 2.4 было показано, что ДЭГ имеет раковинообразный рельеф, образуя трехуровневую микроструктуру слоев, причем размер самых крупных структур в пределах зуба не превышает 100 мкм [87, 88]. Апертура же волновода, использованного в данном исследовании оптического волокна составляла 600 мкм, поэтому относительная интенсивность флуоресценции данной области, прилегающей к ДЭГ должна быть еще выше.
Отметим, что ширина самой ДЭГ очень невелика (менее 15 мкм) и практически не флуоресцирует [43], тем не менее, исследование морфологии ДЭГ [95] показало, что ДЭГ не следует рассматривать как узкую инертную область между дентином и эмалью. ДЭГ представляет собой переходную зону с пространственно–временным градиентом в эмаль и в дентин [96]. Поэтому наблюдаемое нами сильное свечение ДЭГ обусловлено флуоресценцией именно раковистых слоев эмали и дентина, прилегающих к ДЭГ [43].
Некоторый вклад в флуоресценцию раковистых слоев дентина и эмали конечно вносят белки, прежде всего коллаген и амелогенин. Действительно, в области ДЭГ обнаружены, например, коллагеновые фибриллы I типа [86, 88]. Однако, как мы уже указывали ранее, пики флуоресценции твердых тканей зуба не соответствуют пикам флуоресценции компонентов этих белков.
Кроме того, как показано в работе [43] интенсивность свечения раковистых слоев дентина и эмали практически одинакова, в тоже время концентрация белка в дентине существенно выше, чем в эмали. Таким образом, эти результаты можно объяснить только тем, что наблюдаемое свечение твердых тканей зуба, наряду с органической фазой, обусловлено примесной минеральной фазой.
При этом, в свечении раковистых слоев дентина и эмали, прилегающих к ДЭГ, вероятно ключевую роль играют прежде всего КГАП кальция. Действительно, КГАП кальция обнаружены в области ДЭГ, причем их концентрация существенно выше именно вблизи ДЭГ, по сравнению и с эмалью, и с дентином [97, 102, 103]. Более того, концентрация КГАП кальция в эмали, которая располагается ближе к поверхности зуба, гораздо ниже, чем в дентине [104], в то же время интенсивность флуоресценции дентина более чем в два раза выше, по сравнению с интенсивностью флуоресценции эмали (см. рис. 3). Поэтому, если предположить возможность вклада в общий сигнал флуоресценции КГАП кальция, то становится объяснимой более яркая флуоресценция раковистой области ДЭГ.
При этом, как мы говорили ранее, следует учитывать возможное влияние и других замещенных кристаллов ГАП, например, Mg. Тем более, что наибольшая концентрация таких элементов как Mg, F, Cl, не входящих в состав стехиометрического гидроксилапатита кальция, наблюдалась нами также именно в области ДЭГ, а наименьшая – в области эмали. Данные исследования были выполнены на шлифах зубов с помощью метода сканирующей электронной микроскопии (JSM-6380LV, JEOL).