Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

2.2. Фракционный состав ферментативных гидролизатов из хрящевой ткани гидробионтов

В большинстве случаев исследования в области анализа гликозаминогликанов проводятся в следующих направлениях:

1) идентификация различных типов гликозаминогликанов;

2) определение молекулярной массы;

3) структурный анализ доменов гликозаминогликанов.

Идентификацию типов гликозаминогликанов проводят в основном методом ионно-обменной высокоэффективной жидкостной хроматографией на различных сорбентах. Предварительно образцы подвергают последовательному ферментативному гидролизу либо получают производные гликозаминогликанов (Imanari et al., 1996). Структурный анализ доменов гликозаминогликанов заключается в предварительном получении моно-, ди-, три-, тетрасахаридов с помощью специфичных ферментов. С использованием антител на данные сахариды идентифицируют структуры последних и выделяют с помощью аффинной хроматографией. Полученные очищенные сахара подвергают структурному анализу методом ЯМР или капиллярным электрофорезом.

В качестве стандартов для определения молекулярных масс гликозаминогликанов используют нативные монодисперсные гликозаминогликаны либо синтезированные полимеры, такие как сульфатированные декстраны. Вастесен (Wasteson, 1971, цит. по Imanari et al., 1996) впервые показал, что монодисперсные гликозаминогликаны пригодны в качестве стандартов для определения молекулярных масс неизвестных гликозаминогликанов. Также получен монодисперсный гликозаминогликан из коммерческого хондроитинсульфата А трахей быка, рекомендуемый в качестве стандарта для жидкостной хроматографии. Для определения молекулярных масс низкомолекулярных гликозаминогликанов используют также стандарты мономеров гликозаминогликанов (Volpi, 1993; Volpi, Bolagnani, 1993).

Для исследования фракционного состава ферментативных гидролизатов необходимо было использовать хроматографическую систему, позволяющую одновременно анализировать белковые и углеводные компоненты хрящевой ткани. Было показано, что в процессе ферментативного гидролиза, образуется несколько фракций. Все фракции содержат компоненты протеогликановой природы, так как поглощение наблюдается и при рефрактометрическом детектировании и при длине волны 280 нм (рис. 6, а).

Разделение и количественное определение углеводных компонентов, содержащих хондроитинсульфаты и гиалуроновую кислоту, в пробах сравнивали с имеющимися стандартами. В качестве стандартов использовали коммерческие препараты различных типов хондроитинсульфатов: хондроитинсульфат А (ХС А), С (ХС С), D (XC D) и А из осетра (ХС А-1), гиалуроновую кислоту. Сопоставление хроматограмм позволило предположить, что высокомолекулярные фракции, образованные в процессе ферментативного гидролиза, действительно содержат хондроитинсульфаты и гиалуроновую кислоту (рис. 6).

Исследование хроматографического поведения четырех типов хондроитинсульфатов (А, А1, С, Д) на колонке Shodex Asahipak GS-520H показало, что добиться удовлетворительного разделения хондроитинсульфатов не удается вследствие полидисперсности имеющихся стандартов и сходства по времени удерживания при их разделении на колонке, что не может являться показателем для идентификации типов хондроитинсульфатов в неизвестных образцах (рис. 6, 7).

Для регистрации разделяемых компонентов использовали рефрактометрический детектор, сигнал которого пропорционален концентрации вещества и практически не зависит от его природы и молекулярной массы, мы можем идентифицировать пики на хроматограмме, содержащей углеводные полимеры, в составе которых имеются хондроитинсульфаты и гиалуроновая кислота.

Рис. 6. Хроматограммы ферментативного гидролизата из хрящевой ткани осетра (а) и стандартов хондроитинсульфата А (б) и гиалуроновой кислоты (в). Разделение проводили методом ВЭЖХ на колонке Shodex Asahipak GS-520 H. Детектирование осуществляли одновременно рефрактометрическим детектором RID 6A и при УФ 280 нм

Рис. 7. Хроматограмма стандартов хондроитинсульфатов А из трахей быка (ХС А), А из хряща осетра (ХС А 1), С (ХС С) и D (XC D). Разделение проведено методом ВЭЖХ на колонке Shodex Asahipak GS-520H, детектирование RID-6A

Хроматографическое разделение ферментативных гидролизатов, полученных с помощью гепатопанкреатина (рис. 8) из хрящевой ткани гидробионтов, показало, что их состав представлен 7–8 фракциями, которые условно можно разделить на три основных группы: фракции, содержащие высокомолекулярные компоненты (ВМС – 200 кДа и более), среднемолекулярные (СМС – 30–160 кДа) и низкомолекулярные компоненты (НМС – 1–10 кДа и менее). Молекулярно-массовое распределение фракций в гидролизатах, полученных с помощью гепатопанкреатина, представлено в табл. 7. Все фракции содержат компоненты протеогликановой природы, так как поглощение пиков наблюдается при рефрактометрическом детектировании и при 280 нм.

При соблюдении разработанных условий гидролиза хрящевой ткани гепатопанкреатином в препаратах содержание высокомолекулярной фракции, представленной гиалуроновой кислотой и хондроитинсульфатами, аналогично для препаратов из акулы, ската и калуги (34, 36, 33 %, соответственно) и значительно выше в препаратах из лосося и кальмара (51 и 40 %).

После гидролиза хрящевой ткани протамексом в конечном продукте преобладали низкомолекулярные фракции (табл. 7).

Сравнение качественного состава полученных ФГ с препаратами аналогами, показало, что большинство из последних являются монокомпонентными, в состав которых входят либо высокомолекулярные соединения (ВМС) – фармпрепараты «Структум» и «Хонсурид», либо низкомолекулярные (НМС) – БАД «Глюкозаминсуль-фат». БАД к пище «Инолтра» представляет искусственно созданную композицию. ФГ из хрящевой ткани гидробионтов является поликомпонентным, сбалансированным продуктом.

Рис. 8. Хроматограммы ферментативных гидролизатов из хрящевой ткани гидробионтов, полученных с помощью гепатопанкреатина (а – акулы, б – ската, в – осетра, г – лосося, д – кальмара)

Таким образом, исследование молекулярно-массового распределения показало, что ферментативные гидролизаты из хрящевой ткани гидробионтов представляют комплекс продуктов гидролиза протеогликанового комплекса хрящевой ткани различной молекулярной массой.

Таблица 7

Распределение фракций в ферментативных гидролизатах гидробионтов гепатопанкреатином, % от суммы анализируемых фракций

Примечание. n = 3, р < 0,05.