Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

ПАРАТГОРМОН-РОДСТВЕННЫЙ ПРОТЕИН. 2-е издание переработанное и дополненное

Курзанов А. Н., Ледванов М. Ю., Быков И. М., Медведев В. Л., Стрыгина Е. А., Бизенкова М. Н., Заболотских Н. В., Ковалев Д. В., Стукова Н. Ю.,

5.4.1.3.1. Роль паратгормон-родственного протеина и эффекты факторов роста в хондрогенной дифференциации мезенхимальных стволовых клеток и регуляции хондрогенеза

Мезенхимальные стволовые клетки становятся многообещающим источником клеток для регенерации хряща из-за способности к росту in vitro, без потери своего фенотипа. Значительное внимание уделяется повышению способности хондрогенной дифференциации. Несмотря на то, что МСК продемонстрировали большие перспективы в регенерации хряща, необходимо выполнение ряда условий, чтобы они могли эффективно дифференцироваться в хондроциты и поддерживать этот дифференцированный фенотип перед имплантацией. Эти условия включают методы и материалы для культивирования МСК, которые обеспечивают микроэкологический контроль их хондрогенеза. При оптимальных условиях культивирования, содержащих определенные экзогенные факторы, MSC могут быть направлены на хондрогенную дифференциацию. Фаза дифференцировки стволовых клеток в направлении хондрогенеза может быть разделена на различные стадии, включая прикрепление клеток, пролиферацию/дифференцировку и дифференцировку/гипертрофию (Mrugala D. et al., 2009). Обычная система хондрогенеза стволовых клеток in vitro использует культуру гранул, где гранулы, содержащие от 200 000 до 500 000 клеток, подвергают хондрогенной индукции с базальной средой, содержащей коктейль дексаметазона, аскорбиновой кислоты, инсулина, трансферрина и селеновой кислоты. Трансформирующий фактор роста (TGF)- β(TGF- β1, 2 и 3) является наилучшим индуктором хондрогенеза, который приводит к образованию хряща с осаждением сульфатированных гликозаминогликанов (s-GAG) и коллагена II типа. Система культивирования гранул рекапилизует мезенхимальную конденсацию с взаимодействием клеток, необходимых для хондрогенеза (Toh W.S. et al., 2013). Однако эта обычная система культивирования с трансформирующим фактором роста- βможет быть недостаточной для поддержания фенотипической стабильности образования хряща, и для индукции хондрогенеза в направлении стабильного образования хряща требуется более сложные сигналы (Toh W.S. et al., 2011b). Хондрогенная дифференциация МСК также зависит от конкретных факторов роста и сигнальной трансдукции. Несмотря на то, что тканеинженерные конструкции хорошо разработаны для 3D-культуры, поддержание хондрогенного фенотипа проблематично при культивировании МСК только на каркасах, то есть без других локальных факторов in vivo. Чтобы преодолеть эти проблемы, используют ряд новых биоматериалов, инновационных технологий культивирования клеток и недавно обнаруженных факторов роста в соответствии с направлениями тканевой инженерии. Факторы роста являются ключевыми регуляторами правильной дифференциации МСК (Hwang N.S. et al., 2006; Park S. et al., 2007). Факторы роста, которые способствуют хондрогенезу или демонстрируют хондрогенный эффект как in vivo, так и in vitro, включают костные морфогенные белки (BMP), трансформирующие факторы роста- β(TGF- β1, TGF- β3), инсулин-подобные факторы роста (Linkhart T.A. et al., 1996; ODriscoll S.W., 1999; Kil S.J., Carlin C., 2000). Продемонстрированы различия в требованиях к факторам роста для хондрогенной индукции стволовых клеток из разных источников, которые могут определяться особенностями пула рецепторов фактора роста, экспрессируемых клетками (Handorf A.M., Li W.-J., 2014). Своевременное применение факторов роста при оптимальной концентрации, комбинации и воздействии в зависимости от экспрессии соответствующих рецепторов фактора роста необходимо для улучшения хондрогенеза стволовых клеток в направлении стабильного образования хряща Гипоксическая среда являются биоактивным агентом для индуцирования оптимального хондрогенеза МСК. Применение гипоксии во время хондрогенеза, дает последовательные результаты расширенной экспрессии хондрогенных генов и осаждения матриц в различных источниках МСК. Это подчеркивает роль гипоксии во время хондрогенеза, влияние которой опосредованного преимущественно гипоксически-индуцируемыми транскрипционнами факторами, (HIF-1 αи HIF2 α). Было показано, что HIF-1 αулучшает хондрогенез МСК путем индуцирования экспрессии коллагена II типа во взаимодействии с промотором Sox9 (Robins J.C. et al., 2005). Гипоксия усиливает хондрогенную дифференцировку MSC с повышением активности коллагена II типа и аггрекана посредством активации пути АКТ и p38 MAPK (митоген-активированные протеинкиназы) (Kanichai M. et al., 2008; Hirao M. et al., 2006). В дополнение к хондрогенным эффектам гипоксия также оказывает антигипертрофическое и антикатаболическое действие на МСК и хондроциты с понижающей регуляцией экспрессии коллагена X типа, щелочной фосфатазы и матричной металлопротеиназы-13 (Sheehy E.J. et al., 2012; Strobel S. et al., 2010). Гипоксическая репрессия гипертрофии представляет собой комбинированный эффект регуляции посредством активации HDAC4 и Nkx3.2, а также ингибирование Smad6, что приводит к подавлению Runx2 и, следовательно, коллагена X типа (Kawato Y. et al., 2011). Однако в настоящее время взаимосвязь и основные механизмы HIF-1 α и HIF-2 α в катаболической регуляции хондрогенеза, приводящие к гипертрофии, до сих пор неясны. Кроме вышеуказанных факторов индуцировать хондрогенез могут механические воздействия на хондроциты. Электромагнитное поле и комбинация усилий сдвига/динамического сжатия являются лучшими физическими стимуляторами соревания хондроцитов. (Ahmed T.A., Hincke M.T., 2014). Механическая стимуляция с использованием гидростатических нагрузок и растяжения клеток, среди других сил, была применена для активации путей механотрансдукции и содействия хондрогенезу в клетках. (Ogawa H. et al., 2014). Показано, что динамическая стимуляция (например, циклический сдвиг или динамическое сжатие) клеток приводит к образованию более прочного хряща по сравнению с стимуляцией клеток статическими силами. (Grodzinsky A.J. et al., 2000). При развитии хряща механические факторы играют важную роль взаимодействуя с сигнальным контуром Ihh-ПТГрП, регулирующим поддержание и дифференциацию суставных хондроцитов (Chen X. et al., 2008; Vortkamp A. et al., 1996). Экспрессия мРНК ПТГрП возрастает с увеличением амплитуды циклического механического растяжения в культивируемых пластинчатых хондроцитах (Tanaka N. et al., 2005). Механическая стимуляция хондроцитов приводит к секреции ПТГрП, что существеннейшим образом влияет на хондрогенез (Xu T. et al., 2013). Таким образом, есть очевидные доказательства того, что биомеханическая стимуляция хондроцитов является значимым фактором способствующим хондрогенезу. Эти факты стали предпосылками для использования физиологической динамической деформационной нагрузки или скользящей контактной нагрузки при формировании тканеинженерного хряща на основе хондроцитов, что привело к улучшению его механических свойств и биохимических показателей (Lima E.G. et al., 2007; Mauck R.L. et al., 2000, 2002; Bian L. et al., 2010). Такие нагрузочные схемы имитируют циклические воздействия на хрящ in vivo в физиологических условиях, которые, необходимы для поддержания структуры и функции хондроцитов (Buckwalter J.A., Mankin H.J., 1998), а также для усиления конвекции питательных веществ через ткань (Mauck R.L. et al., 2003; Albro M.B. et al., 2008) Кроме того, сложное взаимодействие содержания коллагена и протеогликана обуславливаетк уникальные структурно-функциональные характеристики суставного хряща. Таким образом, применение физико-химических стимулов может модулировать структурную организацию (Kelly T.N. et al., 2006), количество и тип внеклеточного матрикса, что приводит к должным механическим свойствам сконструированной хрящевой ткани. В последние годы реакции хондроцитарной клеточной среды и фенотипические изменения были исследованы в области биоакустофлюидики с использованием ультразвукового поля стоячей волны. В недавнем исследовании была разработана и охарактеризована новая акустофлуидная биореакторная система культивирования агрегатов человеческих суставных хондроцитов, которая применяет акустические силы для механического стимулирования клеток в долгосрочной культуре для создания 3D-гиалиноподобного хряща. Применяя ее исследовали и количественно определяли, как текучие сдвиговые напряжения, создаваемые биореактором, могут быть модулированы в электронном виде и оцениваются в результате различий в качестве образования хряща. Изменяя акустические параметры (амплитуда, частотная развертка и частота повторения развертки), клетки стимулировались колебательными напряжениями сдвига жидкости, которые динамически модулировались с разной частотой повторения развертки. Ме_ханизм механической стимуляции, который способствовал образованию хряща, затем дополнялся фактором роста ПТГрП для улучшения образования гиалиноподобного хряща со структурными и механическими свойствами, сопоставимыми со свойствами человеческого хряща, что оценивалось иммуногистологией и наноиндексацией, соответственно. Поскольку создаваемая ткань представляет собой гиалиноподобный хрящ, его качество оценивали по матричной композиции протеогликанов и коллагена II типа. Затем фракции для этих маркеров сравнивали с коллагеном I типа (маркер для фиброартиляжа) и коллагена X типа (маркер для гипертрофического хряща). Результаты исследования показали, что 21-дневные конструкции, сгенерированные в биореакторе в хондрогенных средах, дополненных ПТГрП, были большими по размеру, проявляли гиалиноподобную структуру хряща, демонстрировали устойчивую экспрессию SOX-9 и коллагена II типа, и, что важно, проявляли незначительную экспрессию коллагенов I типа и X типа. Кроме того, механический анализ ткани хряща с использованием наноиндексации показал, что сконструированные человеческие хрящевые конструкции имеют жесткость, аналогичную жесткости нативной человеческой хрящевой ткани. Результаты этого исследования демонстрируют способность акустофлюидиков обеспечивать настраиваемую биомеханическую силу для культуры и развития гиалиноподобных человеческих хрящевых конструкций in vitro и обеспечивают новую платформу для создания безкаркасных инженерных систем хрящевой ткани. (Jonnalagadda U.S. et al., 2018).

Кроме индукции дифференциации стволовых клеток в хондрогенную линию, контроль фенотипической стабильности образования хряща после дифференциации также имеет решающее значение. Часто факторы и условия, которые усиливают хондрогенную дифференциацию стволовых клеток, также предрасполагают дифференцированные хондроцитоподобные клетки к преждевременной гипертрофии с терминальной прогрессией к апоптозу и замещением костными структурами в физиологическом процессе, известном как эндохондральная оссификация. Гипертротрофия хондроцитов является одним из ключевых физиологических процессов, связанных с продольным ростом длинных костей, однако регуляция гипертрофии также становится все более актуальной для клинического применения мезенхимальных стволовых клеток. Преждевременная гипертрофическая дифференциация хондроцитов является основным препятствием для рутинного использования МСК в генерации стабильного хряща и применения мезенхимальных стволовых клеток для восстановления хрящевых структур. Трансформирующий фактор роста (TGF- β) является сигналом против гипертрофии хондроцитов, тогда как костные морфогенные белки (BMPs) оказывают противоположное влияние. Кроме того, сигнальный путь ПТГрП-Ihh признан самым мощным средством, опосредующим гипертрофию хондроцитов. Понимание перекрестных взаимодействий между TGF- β, BMPs и ПТГрП-Ihh может, таким образом, дать представление об устранении этого нежелательного явления с целью облегчения регенерации функционального и стабильного хряща на клеточной основе (Wang Y. et al., 2015). Развитие хондрогенной дифференциации в направлении гипертрофии может быть связано с тем, что МСК, используемые в существующих подходах в тканевой инженерии в отличие от хряща in vivo, находятся на одном и том же этапе развития и потеряли физиологические пространственные и временные сигналы, которые могут регулировать формирование стабильного хряща. Во время развития скелета последовательная пролиферация и дифференциация хондроцитов жестко контролируется с помощью множества сигнальных путей, играющих жизненно важную роль в регуляции фенотипа хондроцитов. Многочисленные сигнальные пути вовлечены в регуляцию гипертрофических изменений хондрогенеза МСК и хондроцитов. По данным литературы, наиболее важными сигнальными путями являются Wnt, костный морфогенный белок (BMP)/TGF β, ПТГрП-Ihh, фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и гипоксия-индуцируемый фактор (HIF) (Kronenberg H.M., 2003). Понимание этих путей необходимо для использования возможностей контроля гипертрофии хондроцитов в процессе регенерации хряща (Chen S. et al., 2015). ПТГрП блокирует гипертрофию, стимулируя гомеоблок NK3 2 (Nkx3,2) Provot S. et al., 2006) и предотвращая экспрессию RUNX2т (Zhang M. et al., 2009). Предполагается, что SOX9 является мишенью передачи сигналов ПТГрП в пластине роста и что повышенная активность SOX9 может влиять на эффект ПТГрП в поддержании клеток как негипертрофирующихся хондроцитов (Huang W. et al., 2000). Хондрогенная гипертрофия характеризуется увеличением объема клеток более чем в 10 раз и структурным ремоделированием внеклеточного матрикса. Увеличение объема клеток (Bush P.G. et al., 2008) при гипертрофии сопровождается продукцией маркеров терминальной дифференцировки и повышением матричных металлопротеиназ (ММР), включая MMР-13 (Shimizu E. et al., 2010), коллагена X типа (Takeda S. et al., 2001; Stanton L.A. et al., 2004; Arnold M.A. et al., 2007), Ihh (Yoshida C.A. et al., 2004; Mueller M.B., Tuan R.S., 2008) и сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) (Kwon T.G. et al., 2011), которые все являются мишенями фактора транскрипции 2 (Runx2) и функционально способствуют эндохондральная оссификации. MMP-13 деградирует коллаген II (Inada M. et al., 2004) и аггрекан (Fosang A.J. et al., 1996), которые являются ключевыми компонентами внеклеточного матрикса функционального хряща. Коллаген X типа осаждается внутри внеклеточного матрикса и служит основой для последующая кальцификация (Shen G., 2005). Многие сигнальные пути, включая, связанные с ПТГрП-Ihh (Indian Hedgehog), Wingless/Int (Wnt)/ β-ca-/tenin и трансформирующий фактор роста β(TGF- β)/Sma и Mad Related Family (Smad), могут регулировать гипертрофию, но такие факторы, как гипоксия, совместная среда культивирования, эпигенетика и состав биоматериалов также могут влиять на экспрессию Runx2. Контроль гипертрофической дифференциации можно использовать как для восстановления хряща, где необходим стабильный фенотип, но также и при регенерации кости, где гипертрофический хрящ может действовать как шаблон для формирования эндохондральной кости (Studer D. et al., 2012). Grimsrud C.D. et al. (1999) исследовали взаимосвязь трех факторов роста во время созревания хондроцитов в культуре. Они подтвердили, что ПТГрП способен ингибировать созревание клеток, включая торможение индукции мРНК коллагена X типа, активности щелочной фосфатазы, увеличения размера хондроцитов и снижение пролиферации. Кроме того, они показывают, что ПТГрП также отменяет экспрессию мРНК костного морфогенного белка-6 (BMP-6). Ингибирующее действие на созревание хондроцитов может быть быстро отменено путем удаления ПТГрП из культур, и, кроме того, экзогенный BMP-6 может обойти ингибирующее действие ПТГрП на созревание. Хотя многие костные морфогенные белки, включая BMP-6, способны авторегулировать экспрессию мРНК, BMP-6 не смог индуцировать свою собственную продукцию в присутствии ПТГрП, несмотря на его способность индуцировать другие параметры созревания. Эти наблюдения составляют основу для их вывода о том, что подавление ПТГрП гипертрофии хондроцитов происходит путем ингибирования уровней BMP-6 и что гипертрофия может протекать, несмотря на индуцированное ПТГрП подавление эндогенного BMP-6, если клетки снабжены экзогенным костным морфогенным белком. Гипертрофическая дифференциация хондроцитов представляет собой постепенный процесс развития от хондрогенной дифференциации до хрящевой минерализации, которая характеризуется рядом маркеров; каждый из которых имеет свою собственную функцию в ходе трансформации хрящевой ткани (Hellingman C.A. et al., 2012). Например, факторы транскрипции: транскрипционный фактор (RUNX2), ответственный за индуцирование дифференциации мультипотентных мезенхимальных клеток и миоцитарный энхансер фактор-2C (Mef2c), транскрипционный фактор, контролирующий гипертрофию хондроцитов и формирование кости (Arnold M.A. et al., 2007). Предполагается, что MEF2C является основным регулятором Runx2 который действует через Dlx5/Dlx6 (Verzi M.P. et al., 2007), а также маркеры терминальной дифференцировки и в том числе матриксная металлопротеиназа 13 (Studer D. et al., 2012), коллаген X типа, Ihh (Yoshida C.A. et al., 2004), щелочная фосфатаза и сосудистый эндотелиальный фактора роста (Mueller M.B., Tuan R.S., 2008; Kwon T.G. et al., 2011), которые все функционально способствуют эндохондральной оссификации. Ihh через цикл обратной связи ПТГрП-Ihh в эмбриональной пластине роста позволяет ПТГрП контролировать гипертрофию и регулировать пролиферацию хондроцитов (van Donkelaar C.C., Huiskes R., 2006). ПТГрП подавляет гипертрофическую хрящевую дифференцировку, тогда как сигнализация Ihh позитивно регулирует гипертрофический фенотип высокой транскрипцией и экспрессией коллагена X типа и RUNX2. Кроме того, известно, что канонический путь Wnt способствует гипертрофии хондроцитов посредством ингибирования сигнальной активности ПТГрП (Guo X. et al., 2009). Наличие тонкого баланса перекрестных помех между сигнальными путями является требованием для нормального фенотипа хондроцитов (Zhong L. et al., 2015). К сожалению потенциальная хондрогенная гипертрофия дифференцированных клеток в значительной степени игнорируется (Chen S. et al., 2015). Фенотип МСК в восстановлении хряща нестабилен, что указывает на возможность дальнейшей дифференциации в направлении эндохондральной оссификации (Pelttari K. et al., 2006; Hennig T. et al., 2007). Сообщено, что индукция хондрогенеза МСК in vitro обычно сопровождается нежелательной гипертрофической дифференциацией (Mueller M.B., Tuan R.S., 2008). Развитие гипертрофического хряща часто заканчивается началом формирования эндохондральной кости. Для реконструкции хряща это нежелательно, так как хронически дифференцированный хрящ, продуцируемый МСК, минерализуется при имплантации in vivo. Общие протоколы in vitro для хондрогенеза мезенхимальных стволовых клеток индуцируют неадекватный, гипертрофический каскад дифференцировки. В целях модификации хондрогенных протоколов для выявления сильных индукторов, промоторов и ингибиторов хондрогенеза исследовали влияние ряда факторов роста и ПТГрП на раннюю и позднюю хондрогенную дифференциацию мезенхимальных стволовых клеток человека (Weiss S. et al., 2010). Продемонстрировано, что трансформирующий фактор роста (TGF- β) всегда требовался для хондрогенной дифференциации и осаждения коллаген-II-позитивного внеклеточного матрикса, в то время как костный морфогенетический белок (BMP)-2, -4, -6, -7, кислотный фактор роста фибробластов (aFGF) и инсулиноподобный фактор роста I (IGF-I) были по отдельности недостаточно индуктивными. Однако каждый из этих факторов участвовал в активации дифференцировки в комбинации с TGF- β. Основной фактор роста фибробластов (bFGF) или ПТГрП ингибировали TGF- β-ответную экспрессию коллагена II типа, коллагена X типа и индукцию щелочной фосфатазы. Позднее повышение регуляции мРНК PTH1R предполагает, что ранние эффекты ПТГрП могут быть опосредованы рецептор-независимым путем. В то время как TGF- βбыл полным индуктором, bFGF и ПТГрП были мощными ингибиторами раннего и позднего хондрогенеза, вызывая переход от матричного анаболизма к катаболизму не избирательно подавляя экспрессию коллагена X типа. Основной фактор роста фибробластов и ПТГрП могут препятствовать дальнейшей гипертрофической дифференциации клеток, что важно для получения стабильных хондроцитов для целей трансплантации. Предполагается, что используемые в настоящее время условия культивирования могут приводить клетки к терминальной дифференциации и демонстрируется, что методы ингибирования терминальной дифференцировки (через ПТГрП, матричную металлопротеиназу 13 или блокирующее фосфорилирование Smad1/5/8) приводят к образованию хряща с уменьшением гипертрофических маркеров (Hellingman C.A. et al., 2012). Основной фактор роста фибробластов и ПТГрП могут ингибировать раннюю и позднюю хондрогенную дифференцировку МСК путем изменения синтеза и разложения внеклеточного матрикса хряща. Ингибирование происходит не только путем подавления экспрессии коллагена X типа, но также, возможно, путем подавления других хондрогенных белков (Liu Y. et al., 2013). Существующие данные свидетельствуют о том, что хондрогенную гипертрофию можно целенаправленно предотвратить путем использования ряда биологически активных факторов, с тормозящим воздействием на развитие пластины роста таких как ПТГрП (Kim Y.J. et al., 2008; Mueller M.B. et al., 2013), ингибитор трансформирующего фактора роста бета1 (TGF- β1) (Shintani N. et al., 2013), MMP13 (Bertram H. et al., 2009), внеклеточные сигнально-регулируемые ингибиторы протеинкиназ 1 и 2 (Erk1/2) и на уровне генов, таких как NK2-гомеоблока 2 (Nkx3,2), гистондезацетилаза 4 (HDAC4) (Pei M. et al., 2009) и хондромодулин 1 (Ben-Eliezer M. et al., 2007; Mikami Y. et al., 2010). Таким образом, главная проблема регенерации хряща с использованием МСК заключается в обеспечении надлежащей их дифференциации и синтеза матриц во избежание прогрессирования хондрогенной гипертрофии. Гипертрофия хондроцитов контролируется комплексной сетью сигнальных молекул и биофизических факторов, которые вместе представляют широкий диапазон возможных значений для микроэкологической инженерии (Studer D. et al., 2012) Способность ПТГрП регулировать созревание и гипертрофию хондроцитов, а также модулировать хондрогенную дифференциацию МСК является активной областью исследования. Было показано, что N-концевой фрагмент ПТГрП (1–34) ослабляет гипертрофию хондроцитов (Weisser J. et al., 2002). Разные изоформы ПТГрП оказывают различное влияние на хондрогенную дифференцировку и гипертрофию мезенхимальных стволовых клеток. (Lee J.M., Im G.I., 2012). МСК, выделенные из костного мозга, культивировали в хондрогенной среде, содержащей трансформирующий фактор роста и одну из четырех изоформ ПТГрП (1–34, 1–86, 7–34 и 107–139). После 2 недель культивирования in vitro ПТГрП (1–34) значительно увеличивал экспрессию гена и белка хондрогенного маркера коллагена II типа и уменьшал показатели гипертрофических маркеров коллагена X типа и щелочной фосфатазы, в то время как другие изоформы показали противоречивые эффекты. Все изоформы ПТГрП значительно подавляют экспрессию гена и белка Ihh. Изоформа ПТГрП (1–34) наиболее значительно улучшила хондрогенез и подавила гипертрофию в МСК. Благодаря зарегистрированным антигипертрофическим свойствам ПТГрП является эффективной молекулой-кандидатом для улучшения хондрогенеза МСК. Ввиду хорошо исследованного перехода от катаболического к анаболическому отклику в костной ткани, когда ПТГ или ПТГрП вводится с перерывами, а не постоянно (Esbrit P., Alcaraz M.J., 2013), представлялось целесообразным использование импульсного, а не постоянного режима введения ПТГрП, чтобы вызвать благоприятное воздействие на хондрогенез МСК. Это действительно направило МСК на хондрогенную дифференциацию при значительном увеличении содержания пептидов ДНК, протеогликана и коллагена II типа и снижения признаков гипертрофии. Импульсное воздействие ПТГрП может повышать пролиферацию МСК путем активации экспрессии cyclin D1 (Beier F. et al., 2001) или через ингибитор cyclin-зависимой киназы p57 (Kip2), который опосредует пролиферативные действия ПТГрП на хондроциты. (MacLean H.E. et al., 2004). В одной из ранних работ представлены данные о пиковом влиянии ПТГрП на экспрессию коллагена X типа в хондроцитах ростовых эпифизарных пластин через 24 часа (OKeefe R.J. et al., 1997). Импульсное воздействие ПТГрП в течение 6 ч было очевидно достаточным для эффективного стимулирования экспрессии коллагена II типа, но слишком коротким, чтобы оказывать глубокое влияние на экспрессию коллагена X типа. Fischer J. et al. (2014) исследовали, влияние прерывистого воздействия ПТГрП на экспрессию хондрогенных и гипертрофических маркеров дифференцировки: экспрессию гена коллагена II типа, коллагена X типа, Ihh, рецептора PTH1R и матричной металлопротеиназы 13 (MMP13). Результаты исследования позволили констатировать, что прерывистая добавка ПТГрП во время хондрогенеза МСК усиливает экспрессию коллагена II типа и одновременно снижает гипертрофию в соответствии с уровнями Ihh и активностью щелочной фосфатазы. Постоянное воздействие ПТГрП (1–34) ингибирует хондрогенез через сигнализацию cAMP/протеинкиназа A. Поскольку постоянное и прерывистое применение ПТГрП оказывало различное влияние на хондрогенез МСК, авторы пытались выяснить, могут ли они быть опосредованными с помощью расходящихся сигнальных путей. До сих пор мало известно о молекулярных механизмах действия ПТГрП на МСК во время хондрогенеза in vitro. В соответствии с предыдущими результатами впервые показано, что стимуляция сигнализации cAMP/протеинкиназа A форсколином способна полностью воспроизводить как отрицательные эффекты постоянного применения ПТГрП, так и положительные анаболические эффекты прерывистого воздействия ПТГрП на осаждение хондрогенного внеклеточного матрикса. Заключая вышеизложенное можно констатировать, что прерывистое воздействие на МСК во время хондрогенеза представляет собой новое и эффективтое средство для увеличения осаждения хрящевых матриц вместе с одновременным подавлением нежелательных гипертрофических признаков. Несмотря на различающиеся эффекты постоянного и прерывистого воздействия ПТГрП на маркеры хондрогенной дифференцировки при обоих способах введения длительность сигнала является решающей переменной для достижения выявленных эффектов на хондрогенез МСК. Оба режима воздействия влияли на МСК в основном через cAMP/протеинкиназа A-зависимый путь, тогда как участие сигнализации протеинкиназа C-зависимого пути кажется менее важным. В целом эти данные свидетельствуют о целесообразности дальнейшей оптимизации длительности сигнала и частоты импульсов по отношению к концентрации агонистов для полного развертывания потенциала импульсного применения ПТГрП на хондрогенез МСК. Ввиду этого прохондрогенного и антигипертрофического эффекта, наблюдаемого in vitro и первых перспективных результатов in vivo (Kudo S. et al., 2011), сейчас целесообразно рассматривать инъекции ПТГрП, используемые для профилактики остеопороза, в качестве средства поддержки стратегий регенерации хряща на основе МСК в клинических обстоятельствах. В недавней публикации были представлены результаты исследования роли частоты, длительности импульса, общего времени экспозиции и лежащих в ее основе механизмов, чтобы разблокировать весь потенциал действий ПТГрП (Fischer J. et al., 2016). Человеческие МСК в процессе хондрогенеза in vitro в течение шести недель культивирования подвергали импульсному воздействию ПТГрП (1–34). Частоту применения увеличивали с трех раз в неделю (3-6 ч/неделю) до ежедневного поддержания либо продолжительности отдельных импульсов (6 ч/сутки) или общего времени экспозиции (18 ч/неделю, 2,6 ч/день). Ежедневное воздействие ПТГрП на МСК значительно увеличивало осаждение внеклеточного матрикса независимо от продолжительности импульса. Продолжительное общее время экспозиции значительно уменьшало пролиферацию клеток на 14 день. Длительность импульса была критически важна для значительного снижения экспрессии Ihh, но не имеет значения для индуцированного ПТГрП подавления гипертрофических маркеров MEF2C(фактор транскрипции MADS энхансер 2, полипептид С) и IBSP (интегрин связывающий сиалопротеин). Секреция коллагена X типа, фактора транскрипции (RUNX2) и матричной металлопротеиназы 13 остались неизменными. Уменьшение экспрессии IGFBP (инсулиноподобного фактора роста связывающих белков) -2, -3 и -6 предполагает модулированную доступность IGF-I (инсулиноподобный фактор роста-1) в группах ПТГрП, тогда как снижение уровней белка SOX9 во время ПТГрП-импульса может задерживать образование и гипертрофию хондробластов. В целом, оптимизированное время ПТГрП-импульсов продемонстрировало большой потенциал для усиления хондрогенеза МСК возможно, благодаря эффективной балансировке IGF- и SOX9-связанных механизмов регуляции хондрогенеза. Значительное улучшение хондрогенеза МСК путем оптимизации времени прерывистого применения ПТГрП показало огромный потенциал ПТГрП для подавления гипертрофии и стимулирования осаждения хондрогенной матрицы. В качестве наиболее эффективного режима применения ПТГрП определена экспозиция этого белка с МСК в течение 6 часов в день. Таким образом, как и при установленном лечении остеопороза, ежедневные инъекции ПТГрП могут стать клинически значимыми для поддержки стратегий восстановления хряща, основанных на МСК, таких как субхондральный костный микроразрыв и аутологичная имплантация МСК. Исследование влияния факторов роста и ПТГрП на раннюю и позднюю хондрогенную дифференциацию мезенхимальных стволовых клеток человека позволило констатировать, что основной фактор роста фибробластов (bFGF) или ПТГрП ингибировали TGF-бета-индуцированную экспрессию коллагена X типа и индукцию щелочной фосфатазы. Позднее повышение регуляции мРНК рецептора PTH1R предполагает, что ранние эффекты ПТГрП могут быть опосредованы рецептор-независимым путем. Таким образом основной фактор роста фибробластов и ПТГрП являются мощными ингибиторами раннего и позднего хондрогенеза, и не избирательно подавляют экспрессию коллагена X типа (Weiss S. et al., 2010). Утверждается, что паракринная секреция аутологичных хондроцитов (например, связанная с ПТГрП) и/или прямые клеточные клеточные контакты (например, образование щелевых контактов) отвечают за улучшение хондрогенеза МСК (Yang Y. et al., 2012; Aung A. et al., 2011; Lee J.S. Im G.I., 2010; De Windt T.S. et al., 2015). Использование системы совместного культивирования суставных хондроцитов и МСК может усилить хондрогенез и подавить гипертрофию при хондрогенезе МСК. Методы культивирования МСК и аутологичных хондроцитов часто используются для улучшения индукции хондрогенной дифференцировки МСК вместо включения в культуру факторов роста (Yang H.N. et al., 2009; Chen J. et al., 2005). Совместная культура МСК с хондроцитами доказывает эффективную стратегию для образования стабильного хряща в нехондрогенной среде (Ko C.Y. et al., 2016; Kang N. et al., 2013). Совместное культивирование МСК и аутологичных хондроцитов изучалось в различных условиях с контактами клеток или без них. Основное внимание было привлечено к выявлению влияния аутологичных хондроцитов, оказываемого на МСК. Исследования совместного культивирования суставных хондроцитов и МСК свидетельствуют о том, что хондроциты усиливают хондрогенез МСК путем межклеточного взаимодействия посредством прямого клеточного контакта и/или путем секреции морфогенетических факторов в кондиционированной среде, которые еще не полностью охарактеризованы. Как описано в ряде исследований (Hubka K.M. et al., 2014), МСК и суставные хондроциты в соматических культурах прямого контакта с гранулами и каркасами показали улучшенный хондрогенез с более высокой экспрессией генов и синтезом белков хрящевой матрицы, чем один из типов клеток в монокультуре. Помимо влияния хондроцитов, усиливающего хондрогенез МСК, недавние исследования также показали трофические эффекты МСК на функции хондроцитов. Однако результаты, полученные в ходе этих исследований противоречат друг другу и требуют дальнейшего изучения. Например, было обнаружено, что МСК, полученные из костного мозга оказывают трофические эффекты в хондрогенезе путем стимулирования пролиферации хондроцитов и формирования внеклеточного матрикса (Wu L. et al., 2011), и МСК из разных источников ткани, включая синовиальную мембрану, костный мозг и жировую ткань, оказывают эти трофические эффекты, независимо от происхождения ткани (Wu L. et al., 2012). С другой стороны, существуют также исследования, описывающие ингибирующее влияние трофических факторов МСК на хондроциты, где МСК снижали регуляцию хондроцитов и осаждение матриц (Lee J.M. et al., 2012; Xu J. et al., 2013). Механизм, посредством которого совместная культура способствует устойчивому хондрогенезу, включает несколько факторов. Прямой контакт клеток и связь через щелевые соединения могут также играть роль в хондрогенезе МСК (De Windt T.S. et al., 2015). Продемонстрировано, что растворимые факторы, производимые хондроцитами во время совместного культивирования с МСК, являются основной причиной хондрогенеза (Liu X. et al., 2010). Сообщалось, что хондроциты выделяют ряд растворимых факторов, которые способствуют хондрогенезу МСК во время культивирования in vitro, регулируя ремоделирование матрикса, пролиферацию клеток и синтез внеклеточных матричных компонентов стволовыми клетками (Acharya C. et al., 2012; Lettry V. et al., 2010; Cooke M.E. et al., 2011). Растворимые факторы, индуцированные хондроцитами, и прямая совместная культура являются мощными средствами улучшения хондрогенеза и подавления гипертрофического развития МСК. Cекретируемый хондроцитами ПТГрП был идентифицирован как фактор, участвующий в этом эффекте посредством ингибирования продукции коллагена X типа в совместной культуре МСК и человеческих суставных хондроцитов (Fischer et al., 2010). В этом исследовании авторы сравнили экспрессию щелочной фосфатазы, Ihh, коллагена X типа, мРНК ПТГрП суставными хондроцитами и МСК при их раздельном, а также совместном культивировании во время хондрогенеза in vitro, индуцированного TGF β. Установлено, что суставные хондроциты продуцировали мРНК ПТГрП в течение всего периода культивирования. Среда, кондиционированная человеческими суставными хондроцитами, вызывала значительное ингибирование их гипертрофии, о чем свидетельствовала понижающая регуляция in vitro отношения мРНК коллагена X типа к мРНК коллагена II типа, относительное количество осаждения коллагена X типа и активность фермента щелочная фосфатаза. Напротив, МСК секретировали ПТГрП только на ранней фазе дифференцировки до 2–3 недель, а затем уровни мРНК ПТГрП снизились. В последующие недели культивирования МСК была зафиксирована сильная индукция Ihh. Таким образом, МСК отличались от фенотипически стабильной культуры суставных хондроцитов потерей эндогенной экспрессии ПТГрП во время культивирования, в то время как в культуре хондроцитов не наблюдалось такой аутокринной регуляции ПТГрП-Ihh. Дифференцировка МСК в изолированной хондрогенной среде напоминала события в эндрохондральных ростовых пластинах, в которых ПТГрП секретируется незрелыми хондроцитами, тогда как Ihh секретируется позже, что позволяет индуцировать фазу гипертрофии клеток. При совместном культивировании МСК и суставных хондроцитов отмечено существенное улучшения хондрогенеза, вызванного TGF β, путем подавления развития гипертрофии и эктопической матричной минерализации МСК. ПТГрП был идентифицирован как важный растворимый фактор, участвующий в этом действии. Регуляция ПТГрП-Ihh, обнаруженная в этом исследовании, модулирует генерацию хондроцитов, которые не проявляют гипертрофического фенотипа и, таким образом, более подходят для использования в регенерации хряща. Bian L. et al. (2011) исследовали влияние добавление хондроцитов к культурам МСК на свойства тканевого хряща и гипертрофии МСК при культивировании в гидрогелях гиалуроновой кислоты. Смешанные клеточные популяции были инкапсулированы в гидрогели и демонстрировали значительно более высокие модули Юнга, динамические модули, уровни гликозаминогликанов и содержание коллагена, чем конструкции, засеянные только МСК или хондроцитами. Кроме того, осаждение коллагена X типа, маркера гипертрофии МСК, было значительно ниже в конструкциях совместной культуры, чем в конструкциях, засеянных только МСК. Когда МСК и хондроциты культивировали в отдельных гелях, не было улучшения биомеханических и биохимических свойств сконструированной ткани. Авторы полагают, что совместное культивирование МСК и хондроцитов может быть использовано для улучшения свойств и предотвращения кальцификации инженерного хряща, образованного из МСК-сеяных гидрогелей. В недавних исследованиях также изучали паракринные факторы, высвобождаемые хондроцитами, и их роль в системах культивирования с МСК. Сообщалось, что хондроциты выделяют ряд растворимых факторов, которые способствуют хондрогенезу МСК во время культивирования in vitro, регулируя ремоделирование матрикса, пролиферацию клеток и синтез внеклеточных матричных компонентов стволовыми клетками. Например, при объединении в непосредственной близости системы смешанных клеточных культур получали модифицированный хрящ с повышенными механическими свойствами (модуль Юнга и динамический модуль), и биохимическими характеристиками (уровни гликозаминогликанов и содержание коллагена) (Lettry V. et al., 2010; Kubosch E.J. et al., 2016). Интересно, что эти хондроциты также способствовали уменьшению осаждения коллагена X типа (Bian L. et al., 2011; Jikko A. et al., 1999), маркера гипертрофии МСК. Показано, что осаждение матрицы коллагена II типа в совместной культуре происходит исключительно из хондроцитов, а не из МСК (Mo X.T. et al., 2009). Эти результаты указывают на взаимную пользу для поддержания фенотипа в обоих типах клеток – наличие МСК в со-культурах стимулирует производство хондроцитами хрящевой матрицы, а хондроциты, по-видимому, предотвращают или замедляют гипертрофию дифференцирующихся МСК. Важно отметить, что более полная характеристика взаимовлияния влияния этих двух клеточных систем необходима, чтобы полностью реализовать потенциал систем совместного их культивирования. В то время как в ряде исследований было обнаружено положительное влияние хондроцитов на хондрогенную дифференцировку МСК (Hwang N.S. et al., 2007; Alves da Silva M.L. et al., 2015; Zhong J. et al., 2016), в других исследованиях было обнаружено, что положительные эффекты обусловлены трофической ролью МСК в стимулировании пролиферации хондроцитов и осаждения матриц (Wu L. et al., 2011; Wu L. et al., 2012). Констатируется, что ПТГрП может способствовать хондрогенезу и подавлять гипертрофию во время хондрогенеза in vitro с понижающей регуляцией коллагена X типа и RUNX2 и повышающей регуляцией SOX9 и коллагена II типа (Kim Y.J. et al., 2008). Добавление ПТГрП в культуральную среду дозозависимо увеличивало содержание ДНК и глюкозоаминогликанов в гранулах человеческих MSC, Экспрессия гена коллагена I-A1 типа уменьшилась на три четверти, МРНК SOX-9 увеличивалась до четырех раз, а экспрессия гена коллагена типа II-A1 резко увеличивалась в 4–7 раз Экспрессия гена коллагена типа X-A1 уменьшалось на треть, а экспрессия Runx-2 резко снизилась после воздействия ПТГрП. Mueller M.B. et al., (2013) продемонстрировали, что ПТГрП (1–40) снижал экспрессию щелочной фосфатазы в гранулах МСК человека, культивируемых в стандартных хондрогенных условиях дозозависимым образом, Обнаружено, что включение ПТГрП в дозе 1 мкМ или 10 мкМ в хондрогенную индукционную среду привело к значительному подавлению активности коллагена типа X-A1 и щелочной фосфатазы в конструкциях хряща, сконструированных из костномозговых МСК пациентов с остеоартритом (Kafienah W. et al., 2007). Установлено, что изоформы ПТГрП оказывают различное влияние на хондрогенную дифференцировку и гипертрофию мезенхимальных стволовых клеток. ПТГрП (1–34) значительно увеличивал экспрессию гена и белка хондрогенного маркера коллагена типа II-a1 и уменьшал показатели гипертрофических маркеров коллагена типа X-a1 и щелочной фосфатазы, в то время как другие изоформы показали противоречивые эффекты. Все изоформы ПТГрП значительно подавляют экспрессию гена и белка Ihh. Из четырех изоформ ПТГрП (1–34, 1–86, 7–34 и 107–139) наиболее значительно улучшает хондрогенез и подавляет гипертрофию в человеческих МСК ПТГрП (1–34), поддерживая их использование для тканевой инженерии хряща (Lee J.M., Im G.I., 2012). В качестве одного из ключевых факторов препятствующих гипертрофии хондроцитов ПТГрП активирует протеин-фосфатазу II (PP2A) (Huang W. et al., 2000), что приводит к дефосфорилированию HDAC4 и инактивации MEF2C (Kozhemyakina E. et al., 2009). Активация протеинкиназы С ингибирует активность p38 MAPK (Zhen X. et al., 2001). уменьшая фосфорилирование MEF2C (Stanton L.A. et al., 2004) и, в конечном счете, экспрессию гипертрофических генов (Han Y.S. et al., 2004). ПТГрП путем дефосфорилирования кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (CaMKII), существенно блокирует переход от пролиферации хондроцитов к их гипертрофии (Li Y. et al., 2011). Кроме того, ПТГрП блокирует гипертрофию, стимулируя Nkx3,2 (Provot S. et al., 2006) и предотвращая экспрессию RUNX2 (Zhang M. et al., 2009). Nkx3.2 подавляет экспрессию фактора созревания хондроцитов Runx2, а экспрессия Runx2 может нивелировать индуцированную Nkx3.2 блокаду созревания хондроцитов. В совокупности эти результаты показывают, что сигналы ПТГрП блокируют гипертрофию хондроцитов, частично поддерживая экспрессию Nkx3.2/Bapx1, которая, в свою очередь, подавляет экспрессию генов, необходимых для созревания хондроцитов (Provot S. et al., 2006). Сигналы Sonic Hedgehog (Shh) и BMP работают последовательно, чтобы установить положительный регуляторный цикл между SOX9 и Nkx3.2 (Zeng L. et al., 2002). Тенденция к формированию гипертрофированных хондроцитов в ходе дифференцироовки МСК ограничивающая их клиническое применение может быть связана с тем, что МСК, используемые в существующих подходах к тканевой инженерии хрящевой ткани, находятся в условиях, отличающихся от условий их трансформации in vivo. Особенности временной регуляции передачи сигналов ПТГрП в хондрогенетически дифференцирующих МСК, влияние пространственной ПТГрП-сигнализации на созревание хондроцитов, которое более соответствует физиологическим сигнальным взаимосвязям in vivo, все еще недостаточно исследованы. Fahy N. et al., (2018) исследовали влияние пространственного градиента передачи сигналов ПТГрП на хондрогенную дифференциацию МСК. Обычно используемые протоколы для хондрогенной дифференциации МСК in vitro включают в себя определенную среду, содержащую фактор роста (TG-b) 3,4 (Johnstone B. et al., 1998; Barry F. et al., 2001). Однако такие стратегии ограничены из-за тенденции хондрогенно дифференцирующихся МСК трансформироваться в гипертрофические хондроциты после нескольких недель культивирования in vitro, что приводит к нестабильному фенотипу хряща (Pelttari K. et al., 2006; Hellingman C.A. et al., 2010). В отличие от хряща in vivo, МСК, используемые в протоколах продукции тканей хряща, находятся на одном и том же этапе развития и потеряли физиологические пространственные и временные сигналы, которые могут регулировать формирование стабильного суставного хряща. Во время развития скелета последовательная пролиферация и дифференциация хондроцитов жестко контролируется с помощью множества сигнальных путей, играющих жизненно важную роль в регуляции фенотипа хондроцитов. Способность ПТГрП регулировать созревание и гипертрофию хондроцитов определила интерес к ПТГрП-индуцированному модулированию хондрогенной дифференцировки МСК, которая активно исследуется. В текущей литературе подчеркивается важность временного регулирования передачи сигналов ПТГрП в хондрогенезе дифференцирующихся МСК (Fischer J. et al., 2016; Fischer J. et al., 2014). Полученные из костного мозга, МСК человека, трансдуцировали аденовирусными векторами, сверхэкспрессирующими ПТГрП и высеваемыми в различные зоны фибрин-полиэстер-уретанового каркаса, которые культивировали в присутствии или в отсутствие трансформирующего фактора роста (TGF- β1). Экспрессия ПТГрП с помощью 3D-трансдуцированных МСК оказывала ингибирующее действие на гипертрофический маркер MMP-13, который был активирован МСК в ответ на стимуляцию TGF- β1 (Fahy N. et al., 2018). Избыточная экспрессия ПТГрП уменьшала секрецию MMP-13 по сравнению с контролем, а также увеличивала эндогенную продукцию белка TGF- β. Этот эффект ПТГрП на продукцию TGF- β1 варьировал в зависимости от концентрации ПТГрП, которая изменялась в соответствии с применяемой стратегией аденовирусной трансдукции. Авторы продемонстрировали индукцию хондрогенеза МСК в ответ на избыточную экспрессию ПТГрП в отсутствие экзогенной стимуляции TGF- β1. Выявлено значительное увеличение уровней экспрессии гена aggrecan, SOX9 и ПТГрП-рецептора с помощью 3D-трансдуцированных ПТГрП сверхэкспрессирующих МСК по сравнению с контролем. Рецептор ПТГрП не экспрессируется недифференцированными МСК, и он активируется во время хондрогенной дифференциации. (Sekiya I. et al., 2002). Кроме того, 3D-трансдуцированные МСК значительно увеличивают-секрецию глюкозоаминогликана при отсутствии дополнительных хондрогенных стимулов. Эти данные свидетельствуют о потенциальном хондроиндуктивном эффекте гиперэкспрессии ПТГрП на МСК при отсутствии дополнительных стимулов. Наличие пространственного градиента ПТГрП-сигналов способствовало формированию более стабильного фенотипа хондроцитов в активно дифференцирующихся МСК. В дополнение к стимулированию хондрогенной дифференцировки сверхэкспрессия ПТГрП может усилить паракринную активность МСК за счет увеличения продукции TGF- β1, что также может быть выгодным эффектом в области инженерии хрящевой ткани.