Научная электронная библиотека

Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

2.1. Приготовление ДНК проб – ДНК-полимеразная реакция замещения (ник-трансляция)

Используемые реагенты:

1. ДНК-полимераза I из E.соli: 1 мкл препарата содержит 10 единиц фермента.

2. 10-кратный (10х) буфер для ДНК-полимеразы I:

0,5 М трис-НСl (рH 7,5)

0,1 M MgSО4

1 mM дитиотриэтол

500 мкг/мл бычий сывороточный альбумин.

3. ДНКаза I

Готовый раствор содержит ДНКазу I (1 мг/мл) в 0,15 M NаСl и 50 % глицерина.

4. Дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ).

Водные растворы дНТФ в концентрации 0,5 мМ хранятся при температуре –20 °С.

5. Водный раствор меркаптоэтанола в концентрации 0,1 M.

6. Поли-А (10 мг/мл).

7. Меченые биотином, дигоксигенином или флюорофором дНТФ в концентрации 1 мМ;

8. Гибридизационная смесь следующего состава: 2хSSС, 10 % декстрансульфат, 65 % формамид.

Приготовление меченых биотином, дигоксигенином или флюорофором (Сy, FluоrX) ДНК проб (зондов) для FISH осуществляются согласно стандартной процедуры ник-трансляции (Mаniаtis et аl., 1982) с некоторыми модификациями (Юров., 1984). Протокол проведения ник-трансляции представлен ниже.